Les récepteurs neuronaux jouent un rôle clé dans le développement du cerveau, ainsi que dans les processus de mémoire et d’apprentissage. Le developpement d’outils contôlables par la lumière ciblant des populations particulières de récepteurs neuronaux permettra de mieux comprendre les rôles de ces populations de récepteurs dans le cerveau, ainsi que l’intérêt thérapeutique de cibler ces populations. En effet, beaucoup de troubles neurologiques et psychiatriques (épilepsie, retards mentaux, schizophrénie, dépression) s’expliquent par un mauvais fonctionnement des récepteurs neuronaux. Actuellement, un grand nombre de molécules développées pour cibler les récepteurs neuronaux échouent en phase clinique à cause d’effets indésirables (somnolence, problèmes de mémoire, hallucinations, toxicité). Le développement de composés pharmacologiques dépendants de la lumière (photosensible), dont l’activité peut être contrôlée précisément dans l’espace et le temps grâce à leur illumination, devrait amener à de nouveaux médicaments mieux tolérés. En effet, l’idée serait d’administrer un medicament photosensible non actif au patient puis de l’activer temporairement au niveau de la zone concernée par la pathologie, limitant ainsi l’effet délétère que ce médicament pourrait avoir sur d’autres organes.

Nous anticipons les nuisances suivantes sur les larves de Xénope : - Potentielle toxicité des composés pharmacologiques appliqués entraînant la mort des animaux selon les doses appliquées - Potentielle paralysie ou nage erratique des larves en fonction de la dose/efficacité des composés testés, les récepteurs ionotropiques au glutamate jouant un rôle dans la locomotion des larves de Xénope. - Influence directe de certaines longueurs d’onde de lumière sur la nage des larves, léger inconfort oculaire lié à l’utilisation de flashes lumineux. - Potentielle légère gène des larves lors de leur transfert d’un contenant à un autre. - Potentiel léger stress lié à l’isolement durant l’expérience

A l’issue de la procédure, les larves des groupes témoins ont été exposées à des composés pharmacologiques dont nous ne connaissons pas les effets à long-terme sur le développement. Nous ne pouvons donc pas laisser grandir ces animaux pour les replacer dans d’autres laboratoires. En outre l’expérience de comportement qu’ils ont subie est susceptible de modifier leur comportement futur (distance parcourue dans les puits, vitesse de nage, liée à une potentielle habituation). Pour une meilleure reproductibilité des expériences nous préférons donc utiliser des animaux « naïfs » à chaque fois, même pour les groupes contrôle. Enfin, nous serons éventuellement amenés à effectuer des prélèvements post-mortem sur certains animaux pour étudier la pénétration du composé dans le cerveau ou le type de toxicité induite. Tous les animaux seront donc euthanasiés à la fin de la procédure.

Un criblage in silico et des expériences de caractérisation in vitro seront réalisés en amont de ce projet afin de limiter le nombre de composés pharmacologiques à tester et de déterminer la fenêtre de concentration à tester, ainsi que les longueurs d’onde idéales pour la photomodulation. Cela permettra donc de limiter le nombre d’animaux à utiliser. L’étude du comportement des larves en plaques 12 puits avec, pour chaque expérience, deux groupes contrôle et un groupe témoin dans la même plaque permettra de diminuer la variabilité liée aux conditions d’expérimentation, permettant ainsi d’améliorer la puissance statistique des résultats. Le nombre d’animaux estimé pour ce projet est de 7260 : (i) 960 animaux pour une phase pilote permettant d’évaluer les concentrations effectives des composés et leur potentielle toxicité, et (ii) 6300 animaux pour la phase expérimentale à proprement parler. Le calcul des effectifs a été établi par un calcul de puissance. Une analyse statistique sera nécessaire pour l’interprétation des résultats.

Hébergement : Les larves seront élevées en groupes d’individus (maximum 50 par boîte de Pétri) dans un milieu physiologique adapté à leur physiologie dans un incubateur à 23 dégrés jusqu’à ce qu’elles atteignent le stade adéquat. Les larves seront nourries 2 fois par jours à partir du stade 45 avec de la spiruline en poudre. Leur eau sera nettoyée une heure après avoir nourri les larves. Après la procédure, les larves seront remises en groupes de plusieurs individus (correspondant aux groupes expérimentaux) dans un milieu physiologique adapté à leur espèce. L’isolement est évité au maximum. Procédure : Les larves seront habituées pendant 15 min dans l’appareil d’expérimentation avant réalisation de l’expérience. Les expérimentations seront réalisées dans une pièce climatisée à 19 degrés et de l’eau sera ajoutée entre les puits d’expérimentations pour limiter la chauffe du milieu des larves par les flashes de lumière. Les puissances des flashes de lumière seront réglées au minimum nécessaire pour la bonne conduction de l’expérience afin de diminuer un éventuel inconfort oculaire et des réactions parasites à la lumière. Des périodes sans illumination de trois minutes entre chaque flash lumineux sont prévues pour permettre aux larves de récupérer d’un éventuel inconfort lié à la stimulation lumineuse. La toxicité des composés pharmacologiques sera évaluée à deux moments : (1) en amont de l’expérience après une phase d’incubation (30 min) dans les composés photodépendants ; et (2) le lendemain : les larves exposées à nos composés photodépendants seront gardées en observation après l’expérience et leur comportement (nage, orientation du corps, couleur) sera étudiée le lendemain pour estimer le caractère délétère de l’expérience. Les larves seront gardées en groupes de plusieurs individus après la procédure (correspondant aux groupes expérimentaux) dans un milieu physiologique adapté à leur espèce. Les points limites suivants seront considérés : si la santé des larves se détériore après la phase d’incubation ou au cours de l’expérience de comportement (nage frénétique ou paralysie irréversible, décoloration, basculement sur le côté), ou si elles présentent des malformations, l'expérience est immédiatement arrêtée et les larves euthanasiées. Les conditions expérimentales (concentration de composés pharmacologiques, puissance des flashes lumineux) seront alors revues afin d'éviter une souffrance ou un stress aux animaux.

L’espèce Xenopus laevis est particulièrement adaptée à notre étude car les protéines que nous étudions sont très proches entre les xénopes et les humains. Ces protéines sont impliquées dans le mouvement des larves de Xénope : il est ainsi facile d’étudier l’effet d’un composé chimique sur la protéine en observant le comportement de l’animal. Les composés chimiques entrent directement par la peau des animaux et la transparence des larves permet une bonne pénétration de la lumière. On peut donc contrôler la locomotion des larves de xénopes grâce à des composés chimiques et de la lumière sans méthodes invasives. Enfin, La reproduction des xénopes produit des centaines de larves. Leur nombre et leur petite taille (1 cm) permettent des études de comportement impliquant beaucoup d’animaux à la fois ce qui augmente la robustesse des résultats et permet, in fine, de limiter le nombre d’expériences nécessaires. Nous utiliserons ces larves aux stades embryonaires 45 à 50 (4 à 15 jours après fécondation à température ambiante). En effet le stade 45 correspond au stade auquel les larves de xénope commencent à nager de manière spontanée, c’est-à-dire sans avoir besoin de les stimuler.