Lo studio proposto rappresenta il primo approccio volto a definire il ruolo di PTX3, SAP e MSF nell'insorgenza e progressione del PDAC, con particolare interesse al loro coinvolgimento nella formazione della matrice extratumorale e nella migrazione delle cellule tumorali. Sebbene i ruoli di queste molecole siano già stati analizzati in diversi contesti tumorali, il loro contributo nella patogenesi del PDAC non è mai stato studiato. Mediante tecniche di imaging e di genomica, potremo analizzare il ruolo di queste molecole nel rimodellamento della matrice tumorale desmoplastica e nella migrazione delle cellule tumorali, consentendoci quindi di individuare nuovi meccanismi e molecole che possano essere utilizzati come markers prognostici e terapeutici. Alla luce dell'alta aggressività del PDAC e della bassa sopravvivenza dei pazienti a 5 anni dalla diagnosi di malattia (circa 6%), questi studi risultano di grande interesse clinico. Ci aspettiamo infatti che queste molecole abbiano un ruolo nella composizione del microambiente tumorale e che, di conseguenza possano essere utilizzate nella pratica clinica come markers diagnostici e terapeutici per il trattamento della patologia. E' da notare che, negli ultimi 25 anni, l'incidenza, la prevalenza e la mortalità del tumore del pancreas sono aumentate, rispettivamente, del 55%, del 63% e del 53%, indicando come questa patologia rappresenti sempre di più una problematica sanitaria mondiale. Ne consegue che l'impatto economico per la diagnosi e la cura di questa patologia sta progressivamente aumentando, portando alla necessità di individuare nuovi strumenti di diagnosi e terapia rapidi, efficaci ed economici. Il progetto proposto va esattamente in questa direzione, proponendosi di aumentare le conoscenze legate allo sviluppo di questa patologia e portando alla scoperta di nuovi potenziali markers diagnostici e terapeutici.

I modelli di tumorigenesi proposti presentano un livello di sofferenza considerato grave. Tuttavia, in base alle nostre conoscenze sui modelli proposti, gli animali non presentano generalmente segni di sofferenza entro i tempi sperimentali indicati. Per limitare al minimo i livelli di sofferenza, le condizioni di salute degli animali verranno valutate 2 volte alla settimana. Nel caso in cui dovessero presentare difficoltà di movimento o perdita di peso corporeo, il cibo verrà posizionato all'interno della lettiera, in modo da facilitarne l'approvvigionamento. Nel caso dovessero presentarsi i sintomi indicati nella tabella relativa agli end-points umanitari, in base allo score attribuito, verranno presi gli opportuni provvedimenti (come descritto nel paragrafo relativo agli end-points umanitari). In particolare, se dovessero presentarsi isolamento, letargia, anoressia, postura alterata, difficoltà di deambulazione, pelo arruffato, ittero, calo ponderale del 15%, interruzione dell'assunzione di cibo o dell'attività spontanea, l'esperimento verrà interrotto e l'animale sacrificato seguendo le procedure descritte. Tutte le procedure di chirurgia e di imaging verranno eseguite in condizioni di sedazione profonda e gli animali verranno costantemente tenuti su un tappetino riscaldante per evitare la perdita di temperatura corporea. Agli animali anestetizzati verrà inoltre applicato un gel oftalmico per evitare la disidratazione della cornea.

Al termine delle procedure descritte gli animali verranno sacrificati mediante biossido di carbonio (100% per 2-3 minuti) o mediante dissanguamento per perfusione con una soluzione di 2% PFA in anestesia profonda. Il sangue, i tumori e gli organi di interesse (cervello, cuore, polmoni, fegato, pancreas, stomaco, intestino, colon, reni e milza) saranno prelevati per le successive analisi in vitro.

Il numero di animali che verranno utilizzati in ogni esperimento verrà calcolato tenendo conto dell'esigenza di ridurre al minimo il numero di animali coinvolti, pur garantendo la possibilità di ottenere risultati che siano biologicamente e statisticamente validi. I modelli sperimentali che ci proponiamo di utilizzare in questo studio sono ampiamente descritti nella letteratura scientifica e già messi a punto nei nostri laboratori: in particolare, il modello ortotopico di PDAC, che consente di avere tumori nel 100% dei topi trattati, è già stato utilizzato e autorizzato nel nostro laboratorio: questo ci consente di conoscere perfettamente sia la procedura operativa che le tempistiche sperimentali, riducendo al minimo indispensabile il numero di animali che verranno coinvolti nello studio. Inoltre, combinando i dati ottenuti in vivo sulla crescita tumorale con le successive analisi in vitro di microscopia, genomica, biochimica e biologia cellulare eseguite sui tumori espiantati, sarà possibile, da ogni singolo animale, raccogliere il maggior numero di informazioni possibili. Inoltre, le linee cellulari che verranno utilizzate, saranno trasdotte con il gene della luciferina: in questo modo, lo sviluppo e la crescita tumorale verranno monitorate mediante tecniche di in vivo imaging bioluminescente non invasivo, che consentono di visualizzare la progressione della malattia senza la necessità di sacrificare l'animale, migliorando l'approccio sperimentale sia dal punto di vista etico (riduzione del numero di animali utilizzati nei gruppi sperimentali) e statistico (riduzione della variabilità inter-individuale). La numerosità degli animali che verranno utilizzati in ogni gruppo sperimentale è stata calcolata tenendo conto della necessità di ridurre al minimo il numero degli animali coinvolti nelle procedure sperimentali, pur garantendo l'ottenimento di risultati biologicamente e statisticamente validi e significativi per le finalità dello studio. Tale calcolo è stato effettuato in base ai dati precedentemente ottenuti nel nostro laboratorio e definito mediante calcoli statistici basati su dati di letteratura sui modelli proposti (potenza statistica >80% e soglia di significatività di 0.05).

Gli animali saranno stabulati in gruppo, suddivisi in cinque animali per gabbia, in condizioni di temperatura e umidità controllata. All'interno di ogni gabbia verranno inseriti arricchimenti ambientali, al fine di migliorare il benessere degli animali durante il periodo della stabulazione. Tutte le procedure descritte nel progetto verranno eseguite da personale correttamente formato, istruito ed esperto. La manipolazione degli animali sarà ridotta al minimo per evitare ulteriore stress. Le tecniche che prevedono l'inoculo delle cellule tumorali e la chirurgia verranno eseguite in condizioni di anestesia profonda e, quando compatibile con l'esperimento, di analgesia, allo scopo di ridurre la sofferenza dell'animale. Nel caso in cui, durante lo svolgimento delle procedure descritte, dovessero insorgere sintomi di sofferenza (tachipnea, letargia, difficoltà di deambulazione, riduzione dell'assunzione di cibo, postura cifotica, pelo arruffato, calo ponderale superiore al 15%, comparsa di ittero) prima delle tempistiche previste per la conclusione dell'esperimento, l'animale verrà sacrificato ed escluso dalla sperimentazione. Al bisogno, il cibo verrà inumidito e posto a livello della lettiera, in modo da facilitarne l'approvvigionamento. Tuttavia, il modello di PDAC proposto è ampiamente utilizzato in letteratura e già messo a punto nel nostro laboratorio: risulterà quindi più semplice rilevare eventuali anomalie rispetto al decorso atteso. Al fine di ridurre la sofferenza degli animali durante l'esecuzione di alcune procedure descritte nel progetto, sono state previste le seguenti misure: 1) Durante le procedure di in vivo imaging non invasivo e microscopia intravitale, gli animali saranno anestetizzati con una miscela di ketamina/xylazina o con anestesia gassosa mediante inalazione di isoflurano. Successivamente, gli animali verranno posizionati su un tappetino riscaldante, per il mantenimento della corretta temperatura corporea, ed un gel oftalmico verrà applicato sugli occhi, per evitare la disidratazione della cornea. 2) Al momento del sacrificio, allo scopo di ridurre lo stress degli animali, le metodologie di eutanasia (inalazione di CO2 e dissanguamento) non verranno eseguite in presenza di altri animali. 3) In caso di calo ponderale del 10-15% o difficoltà di deambulazione a seguito delle procedure descritte, il cibo, inumidito, verrà messo a livello della lettiera, in modo da agevolarne l'approvvigionamento.

La scelta del modello murino è motivata da una vasta esperienza del nostro laboratorio e da un'ampia letteratura sui modelli di infiammazione che ci proponiamo di utilizzare in questo progetto. Inoltre, negli anni abbiamo generato topi geneticamente modificati che non esprimono Ptx3, che si sono rivelati uno strumento essenziale per identificare le proprietà biologiche di questa molecola, altamente conservata tra topo e uomo, e di trasferire quindi le conoscenze all'uomo. Inoltre, solo nel topo sono stati sviluppati modelli di deficienza delle molecole che riteniamo coinvolte nei processi regolati da PTX3. Per questi motivi riteniamo di aver scelto l'unico modello possibile per sviluppare il progetto.