La generación de nuevas herramientas terapéuticas para el tratamiento del cáncer como la creación de modelos animales, nos permitiran recapitular los resultados observados en líneas celulares sobre el estudio de regulación de RB durante la progresión del ciclo celular. La combinación de modelos genéticos murinos, conjuntamente con el análisis de muestras de tejido primario tumoral, nos servirá para definir el impacto de este mecanismo represor de la proliferación celular en el cáncer escamoso epitelial. El proyecto también nos va a permitir testar una batería de nuevos compuestos, previamiente seleccionados y capaces de mimetizar el mecanismo regulador de RB recientemente identificado, analizando su capacidad para bloquear la división celular tanto en líneas celulares como en los modelos murinos de cáncer. Estos pasos, tanto la adquisicón de un modelo murino de cáncer de piel cómo el screening de moleculas que mejoren la regulación y el control de la progresion celular por parte de RB, abriran en un futuro próximo la posibilidad de trabajar con implantes de muestras derivadas de pacientes (Patient-derived Xenografts-PDX) para completar nuestras futuras investigaciones en dicho campo.

Debido al hecho de que el proyecto se basa en la utilización de animales genéticamente alterados para la función reguladora de la proteina de RB sobre la progresion de ciclo celular, no descritos anteriormente, se considerará que el estudio será de severidad moderada. A pesar de ello, posteriormente a la inducción con carcinogénicps, los animales van a desarrollar tumores de mama o tumores escamosos epiteliales (dependiendo el carcinogeno utilizado) con mayor o menor grado en función del tipo de modificación genética del mutante. De este modo, una vez progrese el tumor se espera que los ratones RB-DD (fosfomiméticos) desarrollen menor numero de tumores, o tumores de menor tamaño y por tanto menor severidad en comparación los los mutantes RB-AA (fosfomutantes), los cuales serán incapaces de ejercer la regulación y control de su ciclo ciclo celular. El destino final de los animales será el sacrificio y la necropsia de los individuos, recuperando los tumores para su procesado y análisis.

El destino final de los animales será el sacrificio y la necropsia de los individuos, recuperando todos los tejidos y muestras necesarias para su análisis. El modelo de inducción de cáncer escamoso epitelial en ratones mediante DMBA- TPA ha sido ampliamente descripto en bibliografía.

Co ayuda de personal Bioestadístico, hemos aplicado métodos de cálculo de tamaño muestral para estimar la N mínima y necesaria, los cuales dependen del tipo de análisis estadístico a realizar. En paralelo, la obtención de MEFs de los distintos ratones mutantes de RB (RB-AA y RB-DD) nos permitirá caracterizar y determinar la relevancia de la regulación de la via de señalización de RB en condiciones basales o de nuestro interés en futuros experimentos en los que se utilizaran fármacos antitumorales (preevaluando su dosis y mecanismo de acción), reduciendo así el número total de animales vivos a utilizar en un futuro

Existe y somos conocedores de la metodología para poder inducir químicamente tumores mamarios (MPA/DMBA) o de piel (DMBA/TPA) 2. Los agentes carcinógenos no tiene efectos secundarios en el ratón más allá de nuestro popósito. Los tumores de desarrollan en órganos específicos cómo son las glándulas mamárias o en la piel según corresponda. 3. Actualmente ya disponemos de los ratones mutantes de Retinoblastoma (RB), background C57BL6/JRj, generados en el del Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas (CNIO). 4. La biología y la fisiología de los ratones C57BL6 está muy bien descrita, son fáciles de manipular y de mantener estabulados. 5. Los resultados obtenidos se podrán comparar con otros modelos celulares y/o otros modelos de cáncer a nivel sistémico (no mimetizable en sistemas de menor complejidad). 6. Los resultados obtenidos podrían ser extrapolados a otros organismos como en humanos. Debido a que los tumores mamarios generados a partir del tratamiento MPA-DMBA tienen un orígen histológico y características similares al cáncer de mama en humanos, esto los hace fácilmente comparables. 7. Previamente, se ha realizado un screening de nuevos compuestos capaces de mimetizar la fosforilación de RB convirtiéndola en un super-represor de la proliferación celular. Los fármacos resultantes del screening se han testado y validado en ensayos in vitro. 8. Los fármacos resultantes del screening pertenecen a famílias ya conocidas y su utilización ampliamente descrita en modelos murinos dónde se describen sus propiedades farmacológicas, las vías, dosis y pautas de administración. Con el propósito de evitar el sufrimiento, dolor o angustia que puedan experimentar los animales durante los procedimientos, se aplicará y evaluará periódicamente un protocolo de supervisión de bienestar animal (a partir de los primeros estadios, durante el desarrollo del tumor, y durante el tratamiento con los fármacos), mediante la elaboración de la tabla de valoración de la severidad a partir de los signos clínicos; físicos y conductuales que presente el animal. Las situaciones en la que se sobrepase la puntuación máxima preestablecida se aplicará el criterio de punto final.

Se utilizacan ratones C57BL6/JRj salvajes y otros modificados genéticamente. Esos ratones seran utilizados a partir de las 3 semanas de vida. La idoneidad del uso de nuestro modelo de estudio se puede resumir en los siguientes puntos: 1. Existe y somos conocedores de los procedimientos para poder inducir químicamente la formación de tumores mamarios a partir de la combinación del tratamiento MPA-DMBA; para desarrollar tumores de piel de los ratones, el proceso está basado en un único tratamiento con el compuesto mutagénico DMBA. El DMBA es un potente iniciador de la carcinogénesis ya que induce mutaciones en el genoma. Tras el tratamiento con DMBA, los animales son tratados con el forbol ester TPA durante 24 semanas. El TPA es un agente pro-inflamatario cuyo tratamiento continuado promueve el desarrollo tumoral a partir de aquellas células troncales que han adquirido mutaciones pro-oncogéncias tras el tratamiento con DMBA. está ámpliamente documentada en la bibliografia. 2. Los carginogenos no tiene más efectos a nivel sistemico de los que nos proponemos. 3. Actualmente ya se han generado los ratones mutantes puntuales de Retinoblastoma (RB), background C57BL6, de manera que ya disponemos del modelo en el que trabajar. 4. La biología y fisiología de los ratones C57BL6 está muy bien descrita. Los tumores se desarrollan en órganos específicos cono son las glándulas mamarias y en la piel segun el protocolo utilizado. 5. Este modelo es relativamente fácil de utilizar y mantener estabulado. 6. Los resultados obtenidos se podrán comparar fácilmente con otros modelos préviamente descritos, hecho que refuerza su uso en el estudio a nivel sistémico. Además, los tumores mamarios tienen un origen histológico y característico similar al cáncer de mama en humanos, hecho que los hace fácilmente comparables. 7. Los compuestos resultantes del screening son famílias de fármacos ya conocidas y su utilización está ampliamente descrita en modelos murinos ya sea en el contexto del cáncer o en otros. Esas publicacions científicas describen sus actividades y propiedades farmacológicas, su bajo y favorable perfil toxicológico así como ciertas indicacions de las vías, dosis y pautas de administración, hecho que contribuye enormemente al refinado de nuestros ensayos in vivo. Actulmente ya se han generado los ratones mutantes puntuales de Retinoblastoma (RB), background C57BL6, de manera que ya disponemos del modelo en el que trabajar.