I disse forsøkene skal vi kartlegge funksjonen til nøkkelgener involvert i sterilitet, kjønnsmodning og sykdomsresistens i oppdrettslaks med hjelp av genredigering i sebrafisk. Vi skal også utvikle selve genredigerings teknologien for bruk i laks. Vi vil bruke genredigeringsverktøy som spesifikt muterer, eller endrer et eller flere gener av interesse. Denne teknologien kan mutere, forandre spesifikt enkeltgener hos alle dyr og planter (sette inn og ta bort genbiter, forandre gener eller bytte ut hele gener). Siden vi målrettet forandrer genene vil fiskene bli karakterisert som GMO. Vi har alle nødvendige godkjenninger fra helsedirektoratet for å kunne gjøre forsøk med GMO-sebrafisk på stasjonen i Bergen. Når man forandrer enkelte gen kan man ikke utelukke at mangel på eller forandring av et gen eller flere gener vil gi lidelse hos fisken. For å forhindre eventuell utilsiktet effekt avlives fisk umiddelbart, dersom fenotypen virker skadelidende på fisken. For å redusere antall dyr som vi studerer, finneklipper (standard prosedyre for finneklipp, hvor man tar en minimal bit av ytterste del av halefinnen, ikke mer enn 1-2 mm av halefinnen) vi fisken tidlig i livsfasen (4 uker og eldre) og vi studerer deretter kun den fisken som har den ønskede genforandringen. Derfor søker vi om en generell tillatelse til å gjennomføre finneklipp for et større antall fisk i flere prosjektet der vi bruker genredigeringsteknologi. Vi kommer til å injisere fertiliserte egg av sebrafisk og deretter ta noen prøver av redigerte embryo. Mesteparten av fisken startfores (ca 200 per gen forandring), og i sebrafisk som er 4 uker eller eldre tar vi en minimal vevsprøve av halefinnen for å identifisere mutert fisk produsert med CRISPR systemet. Om analysen avdekker ønskede genetiske forendringer beholdes fisken gjennom hele livssyklus, eller til vi kan utføre fenotype analyse av interesse (kjønnsmodning, sykdomsresistens etc., her tilkommer spesifikke FOTS godkjenninger for framtidige forsøk dersom disse ikke dekkes av denne søknaden). Positiv fisk beholdes beholdes og krysses ut for å lage stabile linjer av genredigert sebrafisk.

Fertilisering av egg og embryo fra sebrafisk. Alle egg skal injiseres med CRISPR eller Tol2 konstrukt og inkuberes på 28 grader under standard embryo regime. Fisken skal videre på startforing. Larvene startfores med standard larvefór (pulver) og overføres til standard system (etter 14 dager) i sebrafisk lab, der de blir gitt en blanding av artemia og pellets tre ganger daglig. For genotyping/identifikasjon av bærere vil fiskene bedøves med MS-222, og ytterste del av hale vil bli kuttet av for DNA rens. Fisken legges så tilbake i rent vann for oppliving. Inngrepet tar maksimalt ett minutt. Fisken holdes i individuelle bokser inntil screeningen er foretatt. Analyser ved mikroskopi blir gjort i løpet av embryo og juvenil stadiet, og utgjør ingen eksperimentelle inngrep hos fisken. Fiskene vil være bedøvet (MS-222) under mikroskopering, og holdes i vann (med bedøvelse) under prosedyren, og gjenopplives i friskt vann etter mikroskopi. Vevsprøver for andre analyser vil bli foretatt etter avliving, på adult stadiet. Type: sedasjon Preparat: MS-222 Induksjonsdose (mg/L): 168 Vedlikeholdsdose (mg/L): 168 Administrasjonsmåte: i vannet Periode: Før To ulike sedasjoner brukes: Type: Avliving Preparat: MS-222 Induksjonsdose (mg/L): 240 Vedlikeholdsdose (mg/L): 240 Administrasjonsmåte: i vannet

Vi må teste genfunksjonen og metoder i fisk. Siden generasjonstiden i laks er så lang, vil vi derfor her bruke sebrafisk som modelle for laksen. Sebrafisk har kort genersjonstid og er enkel å holde i forsøk.