El objetivo principal de este proyecto es desarrollar un tratamiento para la ELA hereditaria aplicando CRISPR-Cas ancestrales para corregir mutaciones patogénicas en el gen SOD1. El modelo animal elegido para este proyecto es el ratón SOD1G93A, que es el más utilizado para estudiar la ELA. Este ratón tiene una mutación de una sola base en el gen SOD1 que provoca un fenotipo de ELA en aproximadamente 80-90 días. La estrategia de edición para intentar reducir el fenotipo sería introducir deleciones (indels) en el gen SOD1 para reducir la expresión del gen mutante. Para ello, se utilizará una Cas12a ancestral llamada αSynCas con su respectiva guía. El delivery de todas las herramientas se hará mediante dos AAV, uno que portará la secuencia de la Cas12 y otro que porte las guías necesaria para introducir los indels. Para cumplir con el objetivo, los AAV se administrarán por vía intravenosa a los 40-60 días de edad, antes de que empiece a desarrollar el fenotipo de ELA. Después de la infección con virus y que ocurra la edición génica, se controlará el peso corporal de los ratones y se observará el inicio de los signos clínicos. Los ratones editados con CRISPR (se van a utilizar 4 parejas de AAVs diferentes) serán comparados con los controles para evaluar si hay diferencias significativas en el peso corporal, signos clínicos y llegada al criterio de punto final. También se secuenciará el gen SOD1 y los transgenes integrados en el modelo animal, para comprobar que la edición se hizo correctamente. A su vez, se verificará la especificidad de nuestra enzima secuenciando los sitios del genoma que más probabilidad de off-target tengan. Estos sitios se seleccionarán utilizando herramientas tecnológicas como Cas-Offinder. Por último, se realizarán varios análisis post mortem para ver si los ratones editados presentan los mismos niveles de la proteína SOD1 mutada que los controles

Administración intravenosa de AAV. Una sola administración por animal. Todos los animales.

Experimentos previos en cultivos celulares y ex vivo ya han demostrado la utilidad de esta Cas12 para editar el gen SOD1 sin necesidad de una secuencia PAM cerca. Una vez demostrada su utilidad en estos modelos, el siguiente paso previo al uso de esta terapia en humanos sería demostrar su utilidad en modelos animales de ELA. Además, la forma más eficaz a través de la cual podríamos llevar a la endonucleasa Cas12, las guías necesarias al SNC del individuo es mediante AAVs, por lo que su testado en modelos animales adecuados es insalvable una vez tenemos todos los datos previos necesarios in vitro y ex vivo que demuestran que esta combinación de Cas12 más AAV es muy prometedora.