I benefici dello studio sono rappresentati dalla valutazione di approcci terapeutici innovativi, anche affiancati a farmaci convenzionali, per la cura dell'OS, che pur essendo un tumore raro, ha un forte impatto sociale perché prevalentemente colpisce le fasce più giovani della popolazione, bambini, adolescenti e giovani adulti. Lo studio si propone di indagare farmaci di recente sviluppo e altamente innovativi, quali gli inibitori di PARP e farmaci inibitori dell'oncogene MYC, quali omomyc, o farmaci, come ixabepilone, attivi in vitro contro linee di OS con MYC amplificato, alcuni di questi già in uso clinico per altre patologie. Il potenziale ruolo di questi farmaci nell'osteosarcoma merita quindi approfondite indagini. L'OS rappresenta a tutt'oggi una sfida dal punto di vista terapeutico perché ancora non sono stati resi disponibili nuovi farmaci di sicura efficacia nei pazienti con malattia metastatica o che non rispondono alle terapie di prima linea. Fino ad ora nell'OS i farmaci di più recente sviluppo clinico, quali gli inibitori di recettori tirosinchinasici e i farmaci per l'immunoterapia dei tumori hanno dato scarsi risultati. Per questo motivo, oltre la chirurgia e la radioterapia quando possibili, il trattamento è ancora in gran parte basato su l'utilizzo di chemioterapici classici spesso somministrati ad alte dosi. Questo progetto, analizzando terapie innovative, si propone di dare risposte concrete a queste problematiche. I numerosi modelli di OS umano in vitro e in vivo disponibili presso il nostro laboratorio saranno uno strumento importante per valutare l'efficacia delle molecole e la base molecolare della risposta ai farmaci in studio, oltre che per identificare marcatori molecolari che possano essere predittivi della risposta alle terapie e dell'andamento clinico della malattia. La possibilità di poter disporre di dati molecolari e cinetici in associazione a dati di risposta preclinica è un punto di forza del progetto stesso che integra competenze e professionalità diverse.

Il danno che viene arrecato ai topi è quello della crescita del tumore e di eventuali metastasi. Il costante monitoraggio degli animali permetterà di sospendere la procedura in caso di eventuale comparsa di sofferenza. Nel progetto sono delineate le misure adottate per limitare al massimo la sofferenza e il numero dei topi, e per fornire un ambiente e procedure per una stabulazione confortevole e priva di altri stress che non siano quelli necessari dovuti alle manipolazioni per la sperimentazione e alla vita confinata. Le procedure sperimentali del progetto a cui i topi vengono sottoposti, consistono in inoculi sottocutanei, o per via endovenosa di cellule tumorali che possono portare alla crescita di masse tumorali o di noduli metastatici ai polmoni o altri organi interni. Le procedure sperimentali messe a punto ed utilizzate prevedono un continuo monitoraggio della sofferenza dei topi mediante l'osservazione di segni che individuano la comparsa di sofferenza anche lieve. Come risulta dalla tabella degli humane endpoint è previsto che l'esperimento si concluda nel caso compaiano segni di sofferenza, ben prima che vengano raggiunti livelli di sofferenza grave. Nel caso compaiano segni di metastasi ad organi interni (ad esempio anomalie respiratorie) i topi, verranno immediatamente soppressi e sottoposti ad accurata autopsia. Si presume che le procedure saranno da classificarsi come: SV4 Grave Si presume che le procedure saranno da classificarsi come: SV4 Grave

Al termine delle procedure, a un tempo fisso stabilito in base alla velocità di crescita dei diversi modelli tumorali tutti gli animali verranno sacrificati.

Si intende utilizzare il minor numero possibile di animali che consenta di valutare l'efficacia dei trattamenti. Per stabilire il numero minimo di animali necessario ad assicurare la significatività statistica è stato utilizzato il software G*power. Il calcolo dettagliato della numerosità è riportato al punto 21.2 "Considerazioni Statistiche". Inoltre è da notare che tutti i tessuti tumorali prelevati da ogni singolo animale verranno crioconservati o fissati per assicurare una ampia disponibilità di materiale anche per studi molecolari e genetici, o immunoistochimici successivi, per ridurre al minimo il numero di animali da utilizzare.

Le procedure codificate per il trattamento degli animali e l'addestramento del personale mirano ad ottimizzare le condizioni sperimentali e di benessere degli animali e a minimizzare la loro sofferenza. I locali sono dotati di controllo della temperatura e dell'umidità, di ricambio d'aria e ciclo giorno-notte di 12 ore. I topi vengono tenuti in gabbie in numero adeguato secondo le Linee guida Europee. Per migliorare l'ambiente di vita i topi hanno a disposizione "mouse house" o altro materiale di arricchimento ambientale (per soddisfare esigenze comportamentali) (ad esempio cilindri colorati di plastica). Gli esperimenti non si protrarranno oltre il raggiungimento della soglia di crescita tumorale (10% del peso dell'animale) e comunque avranno termine prima del raggiungimento della soglia di sofferenza (si veda Tabella humane endpoint). I topi al termine dell'esperimento vengono sottoposti ad eutanasia per inalazione di biossido di carbonio e dislocazione cervicale. Il personale che manipola i topi è stato specificamente addestrato per la cura degli animali. Assieme al Servizio Veterinario è stata sviluppata una tabella standardizzata di humane endpoint sperimentali che viene allegata. Rispetto a tabelle simili si noti che abbiamo scelto, in coerenza con quanto già facciamo per evitare la sofferenza animale, soglie più basse come humane endpoint, e l'introduzione del grado 4 come singola condizione sufficiente per determinare il sacrificio dell'animale. Il nostro personale controlla costantemente e giornalmente gli animali, utilizzando la tabella per gli humane endpoints, inoltre i medici veterinari, monitorano periodicamente lo stato di salute e le condizioni di benessere degli animali. Per determinare l'insorgenza di tumori o di eventuali metastasi ad organi interni è previsto un controllo accurato degli animali due volte alla settimana sia mediante osservazione visiva generale sia mediante palpazione della zona addominale e di tutta la superficie corporea. Inoltre, gli animali verranno controllati quotidianamente per quanto riguarda la comparsa di eventuali segni di sofferenza che potrebbero costituire un indice d'insorgenza di masse ad organi interni. Come nella patologia umana, gli individui affetti da tumori, anche metastatici, possono restare asintomatici ed avere una buona qualità di vita per lungo tempo. I topi verranno sacrificati prima che la crescita tumorale o metastatica provochi un significativo deterioramento del loro benessere.

Essendo necessario utilizzare modelli in vivo come descritto precedentemente, la specie scelta per questo progetto è il topo. Il topo rappresenta la specie unanimemente ritenuta più idonea a questo tipo di sperimentazioni per le ridotte dimensioni, la disponibilità di ceppi immunodeficienti e le ampie conoscenze genetiche ed immunologiche. I modelli murini scelti sono rappresentati da diversi ceppi di topi immunodeficienti che non sono in grado di rigettare la crescita di cellule umane. I topi NSG sono topi geneticamente modificati, portatori di alterazioni geniche che determinano un fenotipo normale ad eccezione di una forte immunodeficienza, causata dalla totale assenza di linfociti T, B e Natural Killer (NK). Tale condizione se i topi vengono mantenuti in sterilità non induce comunque neoplasie spontanee o patologie di altro genere. Dal momento che, sulla base di dati di letteratura e della nostra esperienza precedente, i sarcomi muscoloscheletrici sono tumori che crescono in modo paragonabile sia nei maschi che nelle femmine, in un'ottica di riduzione, verranno impiegati topi sia di sesso maschile che femminile, omogenei per esperimento.