Ce projet présente un intérêt fondamental via l'étude des mécanismes d'action de la morphine au niveau central, et également un intérêt plus appliqué en permettant éventuellement de proposer de nouvelles cibles thérapeutiques visant à diminuer les effets secondaires dus à la prise chronique de morphine.

Les souris vont soit recevoir une seule injection de morphine (ou de liquide physiologique) en intrapéritonéale qui va induire un effet analgésique ou bien 2 injections/jours pendant 5 jours de morphine (ou de liquide physiologique), qui va provoquer une tolérance ou une hyperalgésie à la morphine qui n’empêche pas les mouvements de l’animal. Par ailleurs, les stimulations mécaniques avec les filaments de Von Frey induisent un retrait de la patte signe d’une douleur modérée. L’animal peut échapper à cette stimulation puisqu’il n’est pas en contention.

Tous les animaux des 2 procédures seront mis à mort. Les 2 procédures sont 2 expériences différentes ne permettant pas de réutiliser les animaux.

Tout d'abord, une réduction sera réalisée dans la partie 1 du projet car les animaux de l'étude « comportement chronique morphine »(objectif 1) seront ré-utilisés pour l'étude des enregistrements électrophysiologiques (objectif 2). De plus, une réduction sera également réalisée dans la partie 2 du projet où nous ne ferons pas de groupe de souris "controle", nous utiliserons le coté contralatéral d'un même animal comme groupe contrôle. Enfin, le nombre de groupes de souris et le nombre de souris par groupe sera réduit au maximum tout en préservant une puissance statistique significative. Le nombre de souris par groupe a été déterminé sur la base des études précédentes et sur un calcul de puissance (http://www. 3rs-reduction.co.uk/html/6__power_and_sample_size.html). Ainsi le calcul de puissance à 80% indique un nombre de 8 souris par groupe pour observer une différence de 50% entre les animaux contrôles et les animaux traités. Afin d'anticiper une perte éventuelle d'animaux liée à la procédure expérimentale (injection...), un nombre maximum de 10 animaux par groupe sera envisagé pour le comportement et les stimulations électriques. La période d’habituation avant le comportement est fondamentale afin d’assurer une reproductibilité des tests et donc de limiter l’hétérogénéité des animaux réduisant le nombre d’animaux utilisés. Enfin, les données récoltées seront analysés par une mesure de variance suivie d’un test de Tukey si normalité vérifiée (sinon test de Mann-Whitney) pour comparer 2 groupes et une ANOVA one-way ou two-way sera réalisée pour comparer plus de 2 groupes expérimentaux.

Les souris bénéficieront d’un enrichissement social: elle seront par groupes de 4 à 6 par cages et environnemental: des rouleaux et des nids seront positionnés dans les cages. Des visites seront réalisées au moins 2 fois par jour et toute observation de signes (points limites) tels que manque de toilettage, piloerection, altération de la posture normale (difficulté à se déplacer, se relever ou se nourrir), déshydratation, température corporelle anormale, agressivité (impossibilité pour la manipulation), vocalisations spontanées, maigreur (perte de plus de 15% du poids) ou obésité, et présence de tumeurs et/ou de lésions sur la peau (sur la face, les yeux et/ou la queue)…mettrait fin à l’expérimentation pour ces animaux par une mise à mort. Pour limiter l’angoisse due aux tests pratiqués, une habituation de minimum une semaine sera réalisée au cours de laquelle les animaux seront placés dans la pièce expérimentale pendant minimum 1h puis ensuite seront exposés aux différents tests sans appliquer le stimulus. Cela permettra aux animaux de s’habituer à l’environnement et à l'expérimentateur limitant ainsi l’impact du stress lié à la procédure expérimentale.

Il est nécessaire de réaliser ces études in vitro chez l’animal car aucune méthode alternative actuelle ne permet d’évaluer les effets de la morphine et les effets de délétion de FLT3 dans le développement de la chronicisation douloureuse. Les souris ont été choisies afin de pouvoir travailler en parallèle sur des souris transgéniques adaptées à nos recherches (dépourvues du gène FLT3) pour mieux comprendre les mécanismes d’action de la morphine dans l'induction de la tolérance/hyperalgésie, et sur des souris sauvages. Les souris auront entre 3 et 8 semaines, ce qui correspond aux âges utilisés dans la littérature.