Opracowano wiele związków heterocyklicznych zawierających azot, jako potencjalne leki przeciwnowotworowe, wykazywały one cytotoksyczność wobec szeregu różnych linii komórek nowotworowych, w tym raka okrężnicy, piersi, płuc, prostaty i komórek białaczkowych linie oraz działanie pro-apoptptyczne. Kilka cząsteczek z grupą piperazyny wykazało działanie przeciwnowotworowe zarówno w badaniach przedklinicznych, jak i klinicznych. Pomimo, że różne pochodne piperazyny zostały zsyntetyzowane jako obiecujące środki przeciwnowotworowe, jednak nadal istnieją pewne wady lub ograniczenia związane z ich syntetycznym rozwojem. W ramach programu National Cancer Institute Developmental Therapeutics Program, realizowanego przez Narodowy Instytut Raka w Stanach Zjednoczonych, zostały sprawdzone właściwości cytotoksyczne pięciu pochodnych piperazyny na 63 liniach komórkowych, dziewięciu typów nowotworów ludzkich. Związki KSK58 oraz KSK99 (GI50 1-10 uM dla KSK58 oraz 0,9-3 uM dla KSK99) wykazały najsilniejsze właściwości hamujące wzrost komórek raka piersi w liniach: MCF7, MDA-MB-231, HS 578T, BT-549, T-47D oraz MDA-MB-468. Stanowi to zatem silną przesłankę to sprawdzenia ich aktywności przeciwnowotworowej w modelu zwierzęcym.

Nie przewidujemy szkodliwych skutków dla zwierząt podczas podań badanych związków (podawane dawki zostały wybrane na podstawie dawek stosowanych dla podobnych pochodnych) jednak gdyby wystąpiła utrata masy ciała (powyżej 15%, utrzymująca się dlużej niż 24h), brak poboru pokarmu i wody i/lub inne objawy zagrażające życiu zwierząt lub powodujących znaczny dyskomfort nastąpi wcześniejsze humanitarne zakończenie eksperymentu. Model mysiego raka gruczołu sutkowego 4T1 przerzutuje do płuc więc w momencie obserwacji pogorszenia stanu zdrowia zwierząt badanie zosyanie zakończone (przewisujemy że ok. 28-30 dnia od wszczepienia komórek). Na zakończeniemyszy zostaną uśmiercone poprzez całkowite skrwawienie w trakcie pobierania materiału (krwi) do dalszych analiz (wcześniej otrzymają lek przeciwbólowy). Zwierzęta zostaną wprowadzone w stan narkozy wziewnej za pomocą 2-3% izofluranu w powietrzu medycznym, a następnie zostanie im pobrana krew z zatoki żylnej oka (tylko w procedurze 2). Sama czynność całkowitego skrwawienia doprowadzi już do uśmiercenia zwierzęcia, jakkolwiek dodatkowo myszom zostanie przerwany rdzeń kręgowy (dyslokacja kręgów szyjnych), post mortem wypreparowane zostaną płuca do dalszych oznaczeń (oszacowanie liczby przerzutów) oraz zostanie przeprowadzona ocena makroskopowa pozostałych narządów wewnętrznych. Prawdopodobne szkody, które mogą być wyrządzone zwierzętom w trakcie przeprowadzania niniejszego badania, będą zrównoważone oczekiwanymi korzyściami realizowanego projektu w postaci określenia aktywności przeciwnowotworowej i przeciwprzerzutowej dwóch nowych pochodnych piperazyny i ich dawkozależność.

Po zakończeniu procedury zwierzęta zostaną uśmiercone w celu pobrania krwi i płuc (tylko w procedurze 2) oraz innych narzadów które zostaną poddane ocenie makroskopowej i zważone. Eutanazja będzie wykonana w znieczuleniu wziewnym (i po wcześniejszym podaniu środka przeciwbólowego), w sposób ograniczający do minimum ból, cierpienie czy stres. Wybrano metodę dyslokacji kręgów szyjnych, szybką i bezbolesną dla zwierzęcia.

Zasada ograniczenia wykorzystanych zwierząt została spełniona poprzez wybór zwierząt jednorodnych genetycznie (myszy szczepu wsobnego) oraz redukcję ich liczby do wymaganego statystycznie minimum. Potwierdzenie bezpieczeństwa dawek badanych związków planuje się wykonać na pojedynczych osobnikach na daną dawkę. Przeprowadzenie badań w sprawdzonym ośrodku, który posiada wysoko wykwalifikowaną kadrę i kilkunastoletnie doświadczenie w przeprowadzaniu tego typu badań zapewni właściwe obchodzenie się ze zwierzętami w trakcie eksperymentów i zminimalizuje ryzyko potrzeby ewentualnego powtórzenia badania oraz użycia dodatkowych zwierząt. Doświadczenie zostanie przeprowadzone na myszach pochodzących z certyfikowanej hodowli europejskiej. Substancje KSK58 i KSK99 zostały wybrane spośród kilku innych, ich aktywność in vitro była potwierdzona na panelu 63 linii komórkowych. Obydwie struktury charakteryzują się wysokim powinowactwem do celów molekularnych: receptorów H3 histaminowych oraz zróżnicowaną siłą wiązania z receptorami sigma-1 oraz sigma-2.

Zasada udoskonalenia badań na zwierzętach została spełniona poprzez podnoszenie kwalifikacji personelu zwierzętarni. Wszyscy pracownicy przechodzą okresowe szkolenia (merytoryczne i praktyczne), doskonalące umiejętności oraz pozwalające na eliminowanie błędów podczas pracy ze zwierzętami. Przez cały okres badania zwierzęta będą miały zapewniony, zgodnie z wytycznymi Dyrektywy Parlamentu Europejskiego i Rady 2010/63/UE oraz nowej Ustawy z dn. 15 stycznia 2015r, wysoki standard życia, odpowiednie warunki bytowe i urozmaicone środowisko chroniące przed nudą (plastikowe rolki służące do zabawy i jako schronienie, domki czy huśtawki). Zwierzęta będą przetrzymywane w warunkach, które zapewniają im stały dostęp wody oraz pokarmu koniecznego do utrzymania zdrowia i witalności. Nie będą również odczuwały dyskomfortu związanego ze środowiskiem. Będą miały zapewnioną wystarczającą przestrzeń, właściwe wyposażenie oraz możliwość kontaktów socjalnych z innymi osobnikami w klatce. W przypadku zachorowania, bólu lub zranienia zapewniona będzie właściwa opieka. Dołożone zostaną wszelkie starania, aby odczucie strachu i stresu wyeliminować do minimum. Opisana w powyższych punktach procedury dobrane zostały tak, aby zwierzęta doświadczalne odczuwały jak najmniejszy dyskomfort (m.in. podanie środka przeciwbólowego przed pobraniem krwi z zatoki żylnej oka).

Badania wykorzystujące zwierzęta laboratoryjne w badaniach przedklinicznych stanowią zasadniczy etap opracowywania nowych metod leczniczych czy nowych produktów leczniczych. W badaniach przedklinicznych myszy laboratoryjne są najczęściej wybieranym gatunkiem zwierząt, ze względu na dobrze poznany genom, dostępność jednorodnych szczepów wsobnych, łatwość wykonania badań, przy jednocześnie dużych możliwościach pobrania materiału i wykonania wielu badań ex vivo. Nie bez znaczenia jest również łatwa obsługa zwierząt i stosunkowo niedrogie utrzymanie. Zaplanowane doświadczenia zostaną przeprowadzone na myszach szczepu wsobnego Balb/c, samicach w wieku ok 7-8 tyg.