Intitulé du projet
Etude comparative de la physiopathologie de l’infection induite par le virus Marburg, souche Popp ou Musoke, chez le macaque cynomolgus et validation d’outil diagnostic associé.
Identifiant du RNT
NTS-FR-813346 v.1, 29-03-2022
Identifiant national du RNT
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Soumission à l’UE
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oui
Durée du projet exprimée en mois.
24
Mots-clés
Virus Marburg
Filovirus
Physiopathologie
Macaque cynomolgus
Diagnostic
Finalité(s) du projet
Recherche translationnelle et appliquée: Troubles infectieux chez l’homme
Recherche translationnelle et appliquée: Diagnostic des maladies
Décrire les objectifs du projet (par exemple, répondre à certaines interrogations scientifiques ou à des besoins scientifiques ou cliniques).
L’étude des maladies infectieuses émergentes (MIE) ou ré émergentes occupe un intérêt majeur en santé publique et dans la recherche scientifique ; et cet intérêt a augmenté depuis l’apparition du SARS-CoV-2. Ainsi, l’état français a décidé de renforcer les capacités de la France à répondre aux épidémies, en mettant l’accent sur le développement d’outils de diagnostic/détection des MIE, mais également en appuyant la recherche, le développement et l’innovation dans la mise au point de traitements contre ces maladies. Notre étude cible le virus Marburg (MARV), de la même famille que le virus Ebola (Filoviridae). Identifié en 1967, il provoque chez l’homme une fièvre hémorragique, dont les symptômes s’apparentent à ceux de la grippe, puis dégénère en une forme plus sévère provoquant saignements, forte fièvre, troubles vasculaires, neurologiques, pulmonaires, douleurs musculaires, et dont l’issue est fatale dans 80% de cas. Ce projet expérimental s'articule autour de deux volets : 1) la caractérisation de la physiopathologie induite par deux souches différentes de MARV (Popp et Musoke), à travers une étude préliminaire réalisée chez le macaque cynomolgus. La description de l'infection de ce modèle animal, par ces deux souches de virus, est une première étape clé pour la mise au point et la validation de nouveaux vaccins ou molécules antivirales. Les souches Musoke et Popp étant disponibles au laboratoire, ce projet portera donc sur la caractérisation de la pathogénicité de la souche Popp en comparaison à la souche Musoke, cette dernière étant déjà décrite. Les animaux seront suivi périodiquement afin de pouvoir étudier l’apparition des symptômes au regard de modifications des constantes biologiques de l’animal. La physiopathologie induite par les deux souches sera également confrontée à l’apparition de la virémie infectieuse et moléculaire mise en évidence à partir de prélèvements sanguins. Pour pouvoir détecter rapidement et efficacement la présence du virus dans le sang d’animaux, il est nécessaire de développer des systèmes de détection moléculaires sensibles et sécurisés. 2) la validation d'un outil de diagnostic dit "au lit du patient". Cette technologie, repose sur l’utilisation d’un système clos de cartouche dans laquelle l’échantillon biologique sera aussitôt traité pour en détecter la présence du virus MARV par PCR en temps réel.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet? Expliquer en quoi le projet pourrait faire progresser les connaissances scientifiques ou quels bénéfices les êtres humains, les animaux ou l’environnement pourraient en tirer à terme. Le cas échéant, distinguer les bénéfices à court terme (pendant la durée du projet) et les bénéfices à long terme (susceptibles d’être obtenus après l’achèvement du projet).
Cette étude permettra la mise en place d’un outil de diagnostic robuste, offrant un avantage considérable en termes de sécurité biologique. De plus, la caractérisation de l’infection chez le primate non-humain, ici le macaque cynomolgus, par voie intramusculaire par MARV (en particulier la souche Popp), posera les bases d’un nouveau système pour l’évaluation in vivo de nouvelles cibles thérapeutiques ou de vaccins ciblant ces pathogènes. 1) Avantages de la caractérisation l’infection de MARV chez le macaque cynomolgus : à court terme, cela permettra de poser les bases d’un modèle détaillé pour l’infection par la souche Popp encore très peu décrite. La comparaison avec la souche Musoke permettra de confirmer et compléter les données de la littérature. Cette étude, première expérimentation du virus MARV chez le primate non-humain (PNH) dans notre laboratoire, nous permettra de développer une table de scoring plus adaptée qui sera appliquée lors de nouvelles expérimentations. Les données obtenues seront partagées au sein de la communauté scientifique. A moyen/long terme, il s'agit de proposer un modèle bien établi ciblant la famille des filovirus (modèle décrit pour Ebola) pour la validation et l’évaluation d’outils thérapeutiques et prophylactiques, étant un enjeu de majeur depuis l’apparition de la Covid-19. 2) Les objectifs de la détection du virus MARV par les cartouches sont de permettre une mise sur le marché d’un outil de diagnostic rapide et sécurisé et à plus long terme, un déploiement en zone épidémique pour détecter suffisamment tôt une infection et en limiter ainsi sa propagation. Cet outil a déjà été mis à disposition en Afrique de l’ouest (détection du virus Ebola, épidémie 2014-2016). De nombreux automates ont été envoyés afin d’augmenter la capacité locale de diagnostic. La mise sur le marché de ces cartouches (détection MARV), viendra renforcer cette capacité à l’aide d’un système rapide (durée réduite du prélèvement au résultat), simple (peu de gestes techniques, limités au dépôt d’échantillon en cartouche), sécurisé (inactivation de l’échantillon en système fermé), et en une seule étape (lyse, extraction d’acides nucléiques et réaction PCR). Le développement de nouvelles cartouches ciblant d’autres agents responsables de fièvres hémorragiques virales, de groupe de risque 4, se poursuivra dans les prochaines années.
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale (par exemple, injections, procédures chirurgicales)? Indiquer le nombre et la durée de ces procédures.
La procédure expérimentale soumettra les animaux à des anesthésies (au nombre de 12 prévues dans la procédure expérimentale et d'une durée de 1h à 2h selon les individus) et à des prélèvements lacrymaux, salivaires, vaginaux et sanguins sur animaux anesthésiés (11 sessions de prélèvements prévues dans cette procédure expérimentale). Lors de l'atteinte de point limite ou de la fin du protocole, les animaux seront anesthésiés, puis les prélèvements de LCR (liquide céphalo-rachidien) et de moelle osseuse seront réalisés avant de procéder à la mise à mort.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux, par exemple, douleur, perte de poids, inactivité/mobilité réduite, stress, comportement anormal, et la durée de ces effets?
La procédure concernée dans ce projet sera de classe sévère et concernera 12 animaux. Les animaux, suite à l'infection par l'une ou l'autre des souches de MARV, devraient présenter des signes cliniques caractéristiques d'une infection par un filovirus et plus particulièrement par MARV, tels qu'une dérégulation de la température corporelle, une perte de poids, une diminution de l'alimentation et de l'hydratation, une perte de tonus et des symptômes hémorragiques. Les animaux présentant des points limite ou un score clinique de 15 (selon notre matrice de score), représentant la limite précoce d'un état de la maladie devenant une limite éthique en termes de douleur/détresse de l'animal, seront anesthésiés puis mis à mort. Une autopsie avec collecte d'échantillons sera alors réalisée.
Quelles espèces et combien d’animaux est-il prévu d’utiliser? Quels sont le degré de gravité des procédures et le nombre d’animaux prévus dans chaque catégorie de gravité (par espèce)?
Espèce
Nombre total
Nombre estimé par degré de gravité
Sans réveil
Légère
Modérée
Sévère
Singes cynomolgus (Macaca fascicularis)
12
Qu’adviendra-t-il des animaux maintenus en vie à la fin de la procédure?
Espèce
Nombre estimé d’animaux à réutiliser, à replacer dans l’habitat/le système d’élevage ou à proposer à l’adoption
Réutilisé
Replacé dans l’habitat naturel ou le système d’élevage
Proposé à l’adoption
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
L'étude comparative de la physiopathologie induite par les deux souches virales d'intérêt implique que les organes et les tissus puissent être prélevés sur l'ensemble des animaux de l'étude (n=12), ceux-ci étant répartis en deux groupes infectés différemment (n=6) et composés chacun d'un égal nombre de mâles et de femelles (n=3 et n=3, respectivement). Par conséquent, seule la mise à mort des 12 animaux de l'étude permettra d'obtenir des données statistiquement robustes.
1. Remplacement
Indiquer quelles sont les alternatives non animales disponibles dans ce domaine et pourquoi elles ne peuvent pas être utilisées aux fins du projet.
Il existe désormais plusieurs méthodes alternatives in vitro, dérivées de la culture cellulaire classiquement utilisée depuis des décennies. Ces nouvelles technologies tendent à recréer artificiellement les interactions inter cellulaires que nous pouvons retrouver dans l'organisme. Citons par exemple le développement de la culture cellulaire en trois dimensions, ou encore la culture d'organoïdes, sphéroïdes ou d'organes sur puce. Dans tous les cas, il s'agit de reconstituer la structure organisationnelle de systèmes cellulaires complexes ex vivo, afin de mimer les conditions observées in vivo. Ces avancées récentes ont déjà permis d'étudier des questions complexes et multidimensionnelles telles que l'apparition de la maladie, la régénération tissulaire ou bien les interactions entre organes. Bien que très prometteuses, ces techniques restent très localisées et répondent à des problématiques assez ciblées, tout en étant multi factorielles. Dans le cadre de notre étude, elles ne permettent pas, pour l'instant, de répondre à des questions globales telles que l'apparition d'une maladie dans un système vivant "entier", le développement symptomatologique ou la mise en place des réactions immunitaires dans leur ensemble. Lors du développement d'un outil de diagnostic (PCR par exemple), les preuves d'efficacité incluent, généralement en première intention, des tests réalisés sur des échantillons mimant les conditions retrouvées sur le terrain. Ainsi, du virus mélangé dans des matrices complexes telles que le plasma, le sang total, la salive, etc. permettent de récréer des prélèvements "naturels" et ainsi valident le test. Cependant, l'outil n'est définitivement validé qu’après avoir été éprouvé à partir de "vrais" prélèvements issus de patients. La complexité de la matrice et les variabilités inhérentes aux individus peuvent induire des résultats imprévisibles et bien différents de ceux observés artificiellement in vitro (présence d'inhibiteurs, changement de composition de la matrice ...). Afin de répondre à nos questions et pour toutes les raisons citées précédemment, il est impossible de remplacer l'utilisation d'un organisme vivant complexe. Le modèle primate non-humain (PNH) est, pour l'étude de l'infection du virus MARV, le seul organisme pouvant reproduire ce qui se passe chez l'homme.
2. Réduction
Expliquer comment le nombre d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé. Décrire les mesures prises pour réduire le nombre d’animaux à utiliser et les principes appliqués pour concevoir les études. S’il y a lieu, décrire les pratiques qui seront appliquées tout au long du projet pour limiter le plus possible le nombre d’animaux utilisés sans perdre de vue les objectifs scientifiques. Ces pratiques peuvent notamment consister en études pilotes, modélisation informatique, partage et réutilisation des tissus.
Il s’agit dans ce projet de réaliser une étude pilote portant sur la description de la physiopathologie induite par deux souches d’un même virus, MARV. Pour permettre cette caractérisation tout en intégrant la variabilité inter-individuelle, les groupes seront constitués de 3 animaux de chaque genre. Ce nombre de 12 animaux a été réduit au maximum afin d’obtenir des résultats interprétables et robustes tout en restant en accord avec les capacités d’hébergement de l’animalerie : 6 animaux seront challengés avec la souche Musoke, 6 animaux seront challengés avec la souche Popp. S’agissant d’une étude pilote, aucun test statistique n’a été réalisé. Cette étude nous permettra à terme, de pouvoir réaliser des tests statistiques (et de puissance) afin d’établir les groupes d’animaux adéquats lors d’une future étude, portant sur ce modèle animal, infecté dans les mêmes conditions.
3. Raffinement
Donner des exemples des mesures spécifiques qui seront prises (par exemple, surveillance accrue, soins postopératoires, gestion de la douleur, entraînement des animaux) pour réduire au minimum les effets sur le bien-être des animaux (les nuisances causées). Décrire les mécanismes permettant d’intégrer de nouvelles techniques de raffinement pendant la durée de vie du projet.
Afin d’assurer au mieux le bien-être des animaux, ils seront hébergés en volière par groupes de 3, dans un environnement enrichi avec des dispositifs favorisant l’adoption d’un comportement naturel (perchoir, hamac, jeu, diversification alimentaire…). Les animaux seront implantés par télémétrie, nous permettant de surveiller et d’enregistrer en temps réel, l’activité et la température corporelle des animaux. Un système de vidéosurveillance permettra également de visualiser le comportement des animaux pendant les périodes où ils ne seront pas stimulés par la présence des techniciens. La surveillance via ce système est réalisée quotidiennement en fin de journée, et plus régulièrement pendant la période critique. L'accès aux enregistrements est également possible. En cas de doute sur l’état d’un ou plusieurs animaux, une entrée en laboratoire sera programmée immédiatement pour procéder à une observation en zone et à une possible décision. Une matrice de score, établie pour l’étude de la physiopathologie induite par les filovirus, nous permettra de réaliser un scoring quotidien (éprouvé sur d’autres protocoles utilisant des primates non-humains) qui sera mis en place dès le jour du challenge et des points limites seront définis à l’avance (hypothermie, pyrexie, perte de poids, durée des symptômes, coma post anesthésie, durée de symptômes persistants, …). L’observation d’un point limite ou l’atteinte d’un score supérieur ou égal à 15 points (représentant la limite précoce d'un état de la maladie devenant une limite éthique en termes de douleur/détresse de l'animal) permettra de mettre fin à la procédure expérimentale pour l’animal concerné.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents
Le modèle PNH, étant phylogénétiquement et physiologiquement proche de l'Homme, est un modèle sensible à l'infection par les filovirus. Comme le révèlent les observations de terrain, les PNH développent des syndromes hémorragiques comparables à ceux décrits chez l'Homme, ce qui en fait un modèle de choix pour l'évaluation de stratégies vaccinales, diagnostiques et thérapeutiques. Certains modèles rongeurs (souris, cobaye, hamster), modèles expérimentaux présentant souvent un système immunitaire déficient, sont sensibles à l'infection par le MARV mais présentent des symptômes et pathologies peu comparables à ceux chez l'humain. La littérature décrit quelques études portant sur l'infection par MARV (selon les souches étudiées) chez le macaque, le marmoset et le babouin. Les animaux concernés par ce protocole seront âgés de 2,5 à 3 ans afin de pouvoir caractériser l'infection par le virus Marburg chez des individus bénéficiant d'un système immunitaire mature. Le système d'hébergement PNH du laboratoire ne permet pas l'hébergement et donc l'étude, d'animaux de plus de 3 ans.
Raisons de l’appréciation rétrospective
Prévoit des procédures sévères
Utilise des primates non humains
Explication de l’autre raison de l’appréciation rétrospective