L'aceruloplasminemia è una malattia negletta sulla quale sono effettuati pochi studi e per cui non esistono terapie. In questo studio individueremo nuovi approcci terapeutici efficaci sul modello murino, che avranno un'importante ricaduta sullo sviluppo di terapie anche nell'uomo, con grande impatto non solo sulla salute di questi pazienti, ma anche di quella dei pazienti con malattie neurodegenerative che coinvolgono la perdita di funzione della ceruloplasmina (ad esempio le malattie di Menkes, di Wilson, il morbo di Alzheimer e di Parkinson). L'approccio con terapia genica che proponiamo è stato testato con successo in altre malattie, ma non ha precedenti per una terapia che agisce anche all'interno del cervello. Ciò avrà un duplice effetto benefico sia sui deficit sistemici che neurologici, superando i limiti della terapia sostitutiva con somministrazione di proteine. Le indicazioni che avremo dal nostro studio sulla bio-disponibilità a livello cerebrale di molecole somministrate via endovena saranno d'interesse generale per la somministrazione di farmaci che agiscono all'interno del sistema nervoso centrale. L'identificazione di un nuovo meccanismo patologico di perdita di barriera farebbe luce sul ruolo dei plessi coroidei nell'aceruloplasminemia, che potrebbe essere rilevante anche in altre malattie genetiche che interessano il sistema nervoso e che potrebbero essere trattate con terapie sostitutive.

Le somministrazioni dei vettori lentivirali e della ceruloplasmina radiomarcata tramite iniezione endovenose in vasi superficiali non apportano dolore all'animale. Il prelievo di sangue dal seno retro-orbitale, che potrebbe generare sofferenza di tipo moderato, e le analisi di tomografia computerizzata saranno condotte in anestesia generale. I test comportamentali previsti non inducono dolore, né creano situazioni di stress. La procedura di eutanasia programmata alla fine del trattamento, che prevede la perfusione dell'animale, sarà eseguita in anestesia profonda, con gli animali in condizioni di non risveglio, quindi non sarà indotto dolore. I topi CpKO sono un modello patologico con sintomatologia clinica lieve nei primi 6-10 mesi, in seguito sviluppano il fenotipo neurodegenerativo, con una sintomatologia grave in animali di età superiore ai 16 mesi. Nel nostro studio, saranno utilizzati topi di massimo 10 mesi, in cui la sintomatologia neurologica è moderata. Tuttavia, il livello di sofferenza indotto agli animali sarà classificato come grave, in considerazione dell'accumulo delle procedure sperimentali in concomitanza con il fenotipo patologico dei topi CpKO. Non è possibile ridurre questi effetti non essendo disponibile alcuna terapia, inoltre verrebbe meno la possibilità di valutare i possibili effetti terapeutici del trattamento sperimentale proposto.

Gli animali al termine delle fasi sperimentali saranno soppressi al fine di prelevare tessuti ed organi destinati ad indagini anatomo-patologiche macro e microscopiche

Sulla base degli studi precedenti effettuati sui topi CpKO con somministrazione di ceruloplasmina a scopo terapeutico, abbiamo calcolato, mediante il programma G*Power, il numero di animali minimo per ottenere dati statisticamente significativi, anche tenendo conto della possibile variabilità di efficacia della terapia. Non essendo documentate nell'aceruloplasminemia differenze fra maschi e femmine nell'incidenza e sintomatologia, useremo entrambi per gli esperimenti, riducendo il numero di animali sperimentali. Per tutti gli esperimenti, i gruppi e la numerosità di topi per gruppo è stata valutata in modo da avere tutti i controlli necessari per una corretta interpretazione dei dati sperimentali, limitando al massimo il numero di animali utilizzati. L'utilizzo dei topi C57Bl/6J-CpKO eterozigoti non idonei provenienti dal progetto in corso, per la generazione degli animali sperimentali, permetterà di ridurre il numero di animali con fenotipo sofferente CpKO generati e utilizzati nel progetto.

L'uso dei modelli di topo per gli studi pre-clinici è giustificato dalla qualità delle informazioni che se ne possono trarre, che non sono raggiungibili attraverso i soli studi in vitro, e che possono portare all'identificazione di possibili terapie per il trattamento dell'aceruloplasminemia. Nell'intero progetto il livello di sofferenza indotto agli animali sarà lieve o moderato per i gruppi di controllo e grave per i topi con fenotipo Cp-KO. Nello studio, dopo la somministrazione dei vettori lentivirali, o ceruloplasmina radiomarcata, non ci si attende sofferenza, tuttavia gli animali saranno tenuti in osservazione durante tutto il periodo sperimentale. L'insorgenza di eventuale sofferenza e stress sarà monitorata misurando una griglia di parametri che consentono di intraprendere azioni correttive o decidere di sopprimere l'animale. Al termine del trattamento, gli animali saranno sacrificati con inalazione di CO2 e dislocazione cervicale, o mediante perfusione con soluzione salina dopo induzione di anestesia profonda. Queste procedure non causano sofferenza in quanto applicate su topi anestetizzati. Non sarà indotto dolore o stress negli animali, sia nelle analisi di tomografia computerizzata (condotte in topi anestetizzati), sia nei test comportamentali di valutazione delle capacità motorie dove non sono presenti stimoli nocivi di alcun genere.

Per il progetto utilizzeremo un modello di topo di aceruloplasminemia, già usato da noi con successo , prodotto e reso disponibile da collaboratori , modello nel quale il gene della ceruloplasmina è stato inattivato. Questi animali mostrano gli aspetti clinici dell'aceruloplasminemia incluse le alterazioni neurologiche e ricapitolano nella loro complessità molti degli aspetti della patologia umana rivelandosi un modello unico per lo studio di questa patologia o, come nel nostro caso, per lo studio di innovativi approcci terapeutici. I topi saranno trattati con vettori lentivirali per indurre la produzione endogena della ceruloplasmina, che è stata dimostrata essere capace di attraversare le barriere che dividono il cervello dal resto del corpo, rendendosi accessibile al tessuto nervoso . L'uso del modello animale è indispensabile per gli studi di farmacocinetica dell'efficacia della terapia genica a livello sistemico e del sistema nervoso centrale, per la valutazione dei parametri comportamentali e motori che riflettono la sintomatologia neurologica.