Décrire les objectifs du projet (par exemple, répondre à certaines interrogations scientifiques ou à des besoins scientifiques ou cliniques).
Ce projet a pour objectif de greffer des cellules souches sanguines humaines et leurs dérivées chez des souris immunodéprimées, et ainsi permettre la reconstitution d’un système immunitaire humain fonctionnel (ou représentatif d’une pathologie particulière) et pouvant être modifié par traitement, en vue d’essais préclinique chez la souris.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet? Expliquer en quoi le projet pourrait faire progresser les connaissances scientifiques ou quels bénéfices les êtres humains, les animaux ou l’environnement pourraient en tirer à terme. Le cas échéant, distinguer les bénéfices à court terme (pendant la durée du projet) et les bénéfices à long terme (susceptibles d’être obtenus après l’achèvement du projet).
En greffant des cellules souches humaines, ou leurs dérivées, à des souris immunodéprimées, nous pouvons reconstituer un système immunitaire humain. Ce faisant, nous apportons un modèle d’étude spécifique qui peut jouer un rôle essentiel dans la compréhension et le traitement de pathologies d’importance, comme certaines infections virales (virus de l’immunodéficience humaine (VIH) ou hépatites), de nombreux cancers ou des maladies inflammatoires (asthme).
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale (par exemple, injections, procédures chirurgicales)? Indiquer le nombre et la durée de ces procédures.
Des prélèvements sanguins seront réalisés sur souris avec ou sans anesthésies. Les volumes maximaux de prélèvements seront proportionnels au poids et à l’âge de l’animal selon un schéma établi et une limite fixée sur une période glissante de 14 jours. Une réhydratation avec du sérum physiologique sera réalisée si nécessaire. La répartition des prélèvements figurera dans le protocole de l’étude et sera contrôlé par un vétérinaire. Chaque prélèvement durera quelques secondes. Pour les analyses nécessitant un volume plus important, un prélèvement terminal sous anesthésie gazeuse sera réalisé. L’anesthésie des nouveau-nés sera réalisée par hypothermie avec de la glace pendant maximum 10 minutes. Des prélèvements vaginaux pourront aussi être pratiqués quotidiennement pendant au moins cinq jours, voire plusieurs semaines pour caractériser le cycle œstral. L’humanisation inclura l’administration d’un agent, détruisant les cellules souches de la moelle osseuse, sur souris vigile, suivie d’une greffe de cellules souches sanguines sur souris vigiles ou nouveau-nés sous anesthésie sur glace. Ces interventions dureront de quelques secondes à quelques minutes. Les animaux recevront des injections de solution saline isotonique contenant des plasmides, une ou deux fois selon la durée de l’étude. Ces injections, administrées uniquement aux souris de plus de 18 g, dureront entre 10 et 15 secondes. Les injections pourront être répétées selon le protocole et dureront quelques secondes. Certaines procédures nécessiteront des actes chirurgicaux pour l’implantation de dispositifs sous-cutanés, réalisés sous anesthésie gazeuse avec une analgésie préopératoire et un suivi post-opératoire rigoureux. L’implantation durera moins de cinq minutes et pourra être répétée selon les besoins de l’étude. À l’issue des études, les animaux non intégrés aux essais précliniques seront euthanasiés selon les méthodes réglementaires. Toutes les interventions seront réalisées sous un suivi clinique rigoureux afin de minimiser douleur et stress des animaux.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux, par exemple, douleur, perte de poids, inactivité/mobilité réduite, stress, comportement anormal, et la durée de ces effets?
-Injection de l’agent myéloablatif : induit une forte douleur abdominale disparaissant en quelques heures. -Injection(s) de solution saline isotonique contenant des plasmides (pour favoriser le développement de populations immunitaires humaines d’intérêt) : peut engendrer des troubles cardio-respiratoires et une altération marquée de l’état général, pendant les minutes suivants l’injection. Peut engendrer un hématome. -Prélèvements vaginaux : peut engendrer une irritation locale, une inflammation ou un stress temporaire. -Chirurgie : douleur, hémorragie, un défaut du système d’anesthésie / analgésie (ex : la souris se réveille en cours de procédure), un état clinique détérioré au réveil (ex : hypothermie), mauvaise cicatrisation. -Administration de traitements : effets potentiellement toxiques des composés à visées thérapeutiques, hématome, douleur, lésion au site d’administration (notamment si administrations répétées) - Prélèvements sanguins : anémie, hématome, douleur, lésion au site de prélèvement (notamment si prélèvement répétés). -Rasage et crème dépilatoire : microlésions, irritations cutanées, gêne (sensation de brûlure de la crème), inflammation transitoire. -Anesthésie : risque d’hypothermie et de sécheresse oculaire (ajout de gel ophtalmique en prévention). -Prélèvement d’urine et de fèces : stress, gêne voire potentiellement douleur si présence de tumeurs au niveau abdominal. La manipulation chez le nouveau-né pourrait engendrer le rejet de la mère. Afin d’éviter cela, des éléments sont décrits dans la procédure expérimentale. Des nuisances peuvent également être induites par le stress dû aux contentions. La douleur peut se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer.
Quelles espèces et combien d’animaux est-il prévu d’utiliser? Quels sont le degré de gravité des procédures et le nombre d’animaux prévus dans chaque catégorie de gravité (par espèce)?
Espèce
Nombre total
Nombre estimé par degré de gravité
Sans réveil
Légère
Modérée
Sévère
Souris (Mus musculus)
45000
Qu’adviendra-t-il des animaux maintenus en vie à la fin de la procédure?
Espèce
Nombre estimé d’animaux à réutiliser, à replacer dans l’habitat/le système d’élevage ou à proposer à l’adoption
Réutilisé
Replacé dans l’habitat naturel ou le système d’élevage
Proposé à l’adoption
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Le processus d’humanisation pourra être accompagné d’une phase de modulation ou de renforcement in vivo du système immunitaire humain en fonction des objectifs expérimentaux. Cette étape vise à préparer les animaux aux études précliniques envisagées en optimisant la réponse immunitaire du modèle humanisé. Les animaux n’étant pas jugés comme aptes à entrer en étude préclinique en projet de formation ou en projet de recherche interne seront euthanasiés. C’est-à-dire les animaux avec un état de santé jugé moyen et/ou avis vétérinaire défavorable. Dans le cadre d’une utilisation continue, pour réaliser les études précliniques, les animaux pourront être intégrés aux autres projets autorisés par le Ministère dans l’établissement utilisateur. Des souris issues de cette procédure pourront être réutilisées dans le projet « Formation interne aux procédures et gestes techniques appliqués aux souris », sous réserve d’un avis vétérinaire favorable. Les animaux concernés seront ceux ayant un taux d’humanisation < 25%. Un nouveau-né mal humanisé pourra être nouvellement humanisé en étant plus âgé. La décision est prise par le vétérinaire.
1. Remplacement
Indiquer quelles sont les alternatives non animales disponibles dans ce domaine et pourquoi elles ne peuvent pas être utilisées aux fins du projet.
Les tests in vitro seront envisagés si ceux-ci sont appropriés. Dans le cadre d’une utilisation continue, les souris humanisées seront impliquées dans des études de recherches précliniques impliquants le système immunitaire. Il n'est actuellement pas possible de recréer in vitro un environnement complexe comme le système immunitaire tout en objectivant les effets potentiellement toxiques d’une molécule en développement. La souris constitue un modèle scientifiquement valide, robuste et indispensable pour le développement et la mise au point de thérapies innovantes pour les patients.
2. Réduction
Expliquer comment le nombre d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé. Décrire les mesures prises pour réduire le nombre d’animaux à utiliser et les principes appliqués pour concevoir les études. S’il y a lieu, décrire les pratiques qui seront appliquées tout au long du projet pour limiter le plus possible le nombre d’animaux utilisés sans perdre de vue les objectifs scientifiques. Ces pratiques peuvent notamment consister en études pilotes, modélisation informatique, partage et réutilisation des tissus.
Un total de 45 000 souris seront utilisées, couvrant une période de 5 ans et permettant de réaliser 720 études précliniques de 50 souris, en se basant sur un taux de succès de l’humanisation de 80%. Aucune approche statistique n'a été réalisée, l’estimation du nombre d’animaux est réalisée sur base du nombre d’études effectuées les années antérieures et anticipant une croissance chaque année, en accord avec le plan commercial. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum.
3. Raffinement
Donner des exemples des mesures spécifiques qui seront prises (par exemple, surveillance accrue, soins postopératoires, gestion de la douleur, entraînement des animaux) pour réduire au minimum les effets sur le bien-être des animaux (les nuisances causées). Décrire les mécanismes permettant d’intégrer de nouvelles techniques de raffinement pendant la durée de vie du projet.
Les souris seront hébergées préférentiellement par groupes sociaux stables composés de 5 individus à partir du sevrage. Des compléments alimentaires pourront être administrés suivant l’état de santé des animaux (dietgel). La cage contiendra à minima une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. Cette couche de litière pourra être supplémentée par un échantillon de litière provenant de cages mâles dans le but de synchroniser le cycle œstral de la souris. En outre, des enrichissements de qualité seront fournis dans chacune des cages : morceaux de bois, tunnel en carton, kraft et/ou boules de cotons. À leur entrée dans l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de minimum 4 jours. Lors d’un changement de zone au sein de l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une nuit au minimum. Pour limiter la douleur, la souffrance et l’angoisse, une échelle de scores cliniques (pelage, mobilité, état général, activité, comportement etc) sera appliquée dès le premier geste invasif ou dès qu’un signe d’altération est observé lors de la surveillance quotidienne. Des traitements antalgiques préventifs et curatifs seront mis en œuvre dès que nécessaire, sous avis vétérinaire notamment buprénorphine 0,1 mg/kg (voie IP ou SC), administrée avant intervention chirurgicale ou toute procédure potentiellement douloureuse. Un rappel sera envisagé toutes les 4–6h selon l’évaluation. Le vétérinaire aura pleine autorité pour euthanasier un animal pour raison éthique ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur s’il/elle le juge nécessaire. Les fréquences sont limitées et une réhydratation est prévue pour tout prélèvement unique à partir de 8 mL/kg. Les points limites déclenchant l’euthanasie incluent : atteinte sévère de l’état général, douleur non contrôlée, ou tout score clinique dépassant les seuils définis.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents
Le séquençage complet du génome de la souris a démontré la proximité phylogénétique des souris et des humains : 90 % des gènes humains ont un équivalent chez la souris, permettant d’élaborer des approches génétiques et fonctionnelles valides. Lorsque les gènes orthologues produisent des effets différents entre souris et humain, le remplacement dans le génome du gène de la souris par son équivalent humain ou de manière fonctionnelle par greffe de cellules humaines dans une lignée immunodéficiente permet la création de lignées humanisées. Depuis de nombreuses années, l'entreprise développe une expertise dans l’humanisation du système immunitaire de multiples souches de souris, notamment les NCG, NXG, NOG et BRG. Fort de cette expérience, il est pertinent de poursuivre le processus d’humanisation sur cette même espèce. La procédure expérimentale requiert l'utilisation de souriceaux nouveau-nés La procédure expérimentale requiert l'utilisation de souriceaux nouveau-nés jusqu'à [MODIFICATION] jusqu'à l'âge de 3,5 - 4,5 semaines, car leur immunité immature favorise la prise de greffe et limite le rejet, garantissant ainsi une reconstitution optimale du système immunitaire humain. À cet âge, le thymus et la moelle osseuse offrent un environnement propice à la maturation des cellules immunitaires humaines, permettant d'obtenir un modèle plus fonctionnel et reproductible.
Raisons de l’appréciation rétrospective
Prévoit des procédures sévères
Utilise des primates non humains
Explication de l’autre raison de l’appréciation rétrospective