Wyniki badań realizowanych w proponowanym projekcie pozwolą na: A. Ocenę aktywności przeciwdepresyjnej i przeciwlękowej kompleksu LPD-Mg w testach behawioralnych u myszy. B. Porównanie aktywności przeciwdepresyjnej kompleksu LPD-Mg z aktywnością przeciwdepresyjną zastosowanych pojedynczo dawek działających LPDi Mg2+ oraz podanych łącznie dawek subterapeutycznych LPD i Mg2+ w testach behawioralnych u myszy. C. Zwiększenie skuteczności i bezpieczeństwa leczenia pacjentów z zaburzeniami depresyjnymi.

Procedury wykonywane na zwierzętach, w wyniku których zwierzęta mogą doświadczać krótkotrwałego umiarkowanego bólu, cierpienia, dystresu, i które mogą powodować umiarkowane niekorzystne oddziaływanie na dobrostan lub ogólny stan zwierząt, określane są jako „umiarkowane”. Zastosowanie w doświadczeniach zewnętrznych urządzeń telemetrycznych, ma jedynie niewielkie niekorzystne oddziaływanie na zwierzęta lub w niewielkim stopniu zakłóca ich normalną aktywność i zachowanie. Nie przewiduje się, że badane substancje spowodują jakiekolwiek wykrywalne działania niepożądane u zwierząt.

Zwierzęta uśmiercone zostaną poprzez dekapitację po zakończeniu zaplanowanych czynności, w celu pobrania tkanek do dalszej analizy. Jest to jedyna metoda uśmiercenia, która pozwala na uzyskanie materiału biologicznego odpowiedniej jakości niezbędnego do przeprowadzenia analizy biochemicznej. Zaplanowana metoda uśmiercania jest zgodna z załącznikiem nr IV do dyrektywy Parlamentu Europejskiego i Rady 2010/63/UE z dnia 22 września 2010 r. w sprawie ochrony zwierząt wykorzystywanych do celów naukowych. W przypadku pojawienia się losowych problemów zdrowotnych u myszy, badacze skonsultują się z lekarzem weterynarii i jeżeli będzie to konieczne, chore zwierzę zostanie uśmiercone (wczesne i humanitarne zakończenie procedury) przy użyciu dwutlenku węgla, metodą stopniowego napełniania, zgodnej z załącznikiem nr IV do dyrektywy Parlamentu Europejskiego i Rady 2010/63/UE z dnia 22 września 2010 r. w sprawie ochrony zwierząt wykorzystywanych do celów naukowych. Objawy będące podstawą decyzji o uśmierceniu zwierzęcia to: widoczny spadek wagi (powyżej 20%), brak apetytu, apatia, widocznie ograniczona ruchliwość lub utrata koordynacji ciała (zataczanie/przewracanie), nastroszona sierść, a także zła reakcja zwierzęcia na podawane substancje (m.in. szybki, niedający się ustabilizować oddech, drgawki).

Zaplanowana grupa doświadczalna liczyć będzie po 10 myszy. Liczba zwierząt została ograniczona do niezbędnego minimum, koniecznego do osiągnięcia celów doświadczenia. Jest to najmniejsza liczba z możliwych z punktu widzenia statystycznej weryfikacji wyników (test t-Studenta, analiza wariancji jedno- i dwuczynnikowa ANOVA, użycie odpowiedniego testu posthoc, np. Newmana i Keulsa, Bonferroniego). oraz zasadą zastąpienia, ograniczenia i udoskonalenia (3R) umożliwiając wykonanie zaplanowanych badań. Za poziom istotności statystycznej uzyskanych wyników przyjęto p = 0,05 oraz moc testu β = 0,8. Ponadto w celu zmniejszenia liczby zwierząt potrzebnych do zrealizowania projektu badawczego, ze względu na małą inwazyjność badania spontanicznej aktywności lokomotorycznej, bezpośrednio po jego przeprowadzeniu zwierzęta zostaną poddane testowi zawieszania za ogon, a bezpośrednio po teście podniesionego labiryntu krzyżowego zostaną poddane testowi zagrzebywania kulek. Liczebność grup ustalono na podstawie wstępnych doświadczeń własnych i piśmiennictwa.

Zaplanowane we wniosku procedury obejmują czynności konieczne do prawidłowego przeprowadzenia eksperymentu oraz uzyskania wiarygodnych wyników. W celu ograniczenia stresu zwierząt związanego z doświadczeniami planuje się przeprowadzenie handlingu. Zaproponowane testy (ocena aktywności lokomotorycznej, TST, Novelty-Suppressed Feeding, EPM, test zagrzebywania kulek) są standardowo używane do oceny właściwości przeciwdepresyjnych i przeciwlękowych. Eksperymenty zostaną przeprowadzone przez doświadczonych eksperymentatorów, ograniczając dyskomfort zwierząt podczas przebiegu doświadczenia. Za wyjątkiem krótkich przerw wynikających z podania leku i czasu trwania doświadczenia zwierzęta będą miały nieograniczony dostęp do wody oraz stałe warunki otoczenia (temperatura,, wilgotność, oświetlenie). Myszy będą miały zapewnione odpowiednie warunki bytowania w tym wzbogacone środowisko (drewniane klocki, domki, poziom hałasu nie przekraczający 60 db – normalna rozmowa). Procedury zaplanowane są tak, aby uniknąć w ich wyniku śmierci zwierząt. Jeżeli jednak podczas monitorowania stanu zdrowia zwierząt zostałyby stwierdzone dwa spośród wymienionych poniżej objawów wskazujących na cierpienie osobnika, planowane jest wczesne i humanitarne zakończenie udziału zwierzęcia w procedurze. Objawy będące podstawą decyzji o wczesnym humanitarnym zakończeniu zwierzęcia w doświadczeniu to: widoczny spadek wagi (powyżej 20%), brak apetytu, apatia, widocznie ograniczona ruchliwość lub utrata koordynacji ciała (zataczanie/przewracanie), nastroszona sierść, a także zła reakcja zwierzęcia na podawane substancje (m.in. szybki, niedający się ustabilizować oddech, drgawki). W okresie przeprowadzania eksperymentów zwierzęta będą pod stałą opieką lekarza weterynarii. Wszelkie zaobserwowane zaburzenia zdrowia myszy będą konsultowane z lekarzem weterynarii, a jego zalecenia natychmiast wdrażane. Po zakończonych badaniach od zwierząt pobrany zostanie materiał biologiczny, tj. krew i wybrane struktury mózgu, który zostanie poddany dalszej analizie biochemicznej (spektroskopia mas, Western blot, immunofluorescencja, HPLC) i farmakokinetycznej (ocena poziomów badanych związków we krwi i odpowiednich strukturach mózgu .

Eksperymenty zostaną przeprowadzone na dorosłych samcach myszy domowej stada Albino Swiss, które są powszechnie wykorzystywane w badaniach mających na celu określenie potencjału przeciwdepresyjnego badanych substancji. Do badań wybrane zostały dorosłe samce, tak aby zminimalizować wahania w otrzymywanych wynikach spowodowane m.in. różnym stadium rozwojowym i/lub zmianami hormonalnymi związanymi z różnymi stadiami cyklu rujowego u samic. Myszy tej rasy zostały wybrane na podstawie wcześniejszych badań, a jej zastosowanie w podobnym wieku rozwojowym zapewnia powtarzalność pomiarów i minimalizuje zmienność. Modele badawcze zostały wielokrotnie sprawdzone oraz odpowiednio dobrane na podstawie wcześniejszych doświadczeń.