Décrire les objectifs du projet (par exemple, répondre à certaines interrogations scientifiques ou à des besoins scientifiques ou cliniques).
L’Homme peut être atteint de maladies génétiques, affectant la synthèse par notre corps, de protéines indispensables à la vie. Selon le gène et les modifications de l’ADN, la protéine qui aurait dû être produite peut être absente, ou présente mais non fonctionnelle. L’administration de la protéine manquante sous forme de médicament est alors la meilleure thérapie. Nous avons choisi de produire des protéines recombinantes (car produites par une cellule dont le matériel génétique a été modifié par recombinaison génétique) à partir de la glande mammaire de lapines génétiquement modifiées, pour les récupérer dans le lait lors de la lactation. Les protéines recombinantes seront ensuite purifiées et deviendront des médicaments. Ce dossier présente nos activités de recherche : 1. l'optimisation de la production de protéines recombinantes. En effet, nous voulons améliorer la qualité et l’efficacité des protéines recombinantes produites dans le lait de lapines transgéniques, en modifiant leur génome par transgénèse, dans des embryons au stade une cellule. 2. notre société avait créé des lapines transgéniques produisant dans leur lait, l’inhibiteur C1 estérase recombinant (InhC1), utilisé comme médicament pour soigner les patients souffrant d’angioœdème héréditaire (AOH). Cette maladie génétique rare, causée par le déficit de production de la protéine inhibiteur C1 estérase, se caractérise par la survenue d'œdèmes sous-cutanés et/ou sous-muqueux, entrainant un gonflement localisé des tissus, de fortes douleurs abdominales et des décès (25% des cas) sans traitement approprié. Du fait de l’augmentation de la demande de l’InhC1 pour traiter l’AOH, les tests précliniques en cours pour d’autres pathologies (Covid-19) et pour renouveler les lapines transgéniques de 4ème génération produisant l’InhC1 dans notre animalerie de production, nous avons besoin de régénérer des lapins transgéniques de 2èmes et 3èmes générations à partir de semence transgénique de mâles des 1ères et 2èmes générations. Leur sperme avait été congelé il y a plus de 20 ans et ne parvient plus à féconder des lapines lors d’inséminations artificielles. Pour pallier ce problème, nous devons utiliser l’ICSI (Intra Cytoplasmic Sperm Injection, plus efficace que la fécondation in vitro) qui permet d’introduire un spermatozoïde dans l’ovule pour le féconder, puis le transférer dans l’utérus de lapines receveuses, pour régénérer des animaux transgéniques InhC1 de 2ème et 3èmes générations.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet? Expliquer en quoi le projet pourrait faire progresser les connaissances scientifiques ou quels bénéfices les êtres humains, les animaux ou l’environnement pourraient en tirer à terme. Le cas échéant, distinguer les bénéfices à court terme (pendant la durée du projet) et les bénéfices à long terme (susceptibles d’être obtenus après l’achèvement du projet).
Nous avons déjà produit des protéines thérapeutiques pour l'Homme en utilisant des lapines trangéniques, ce qui nous a permis de commercialiser en 2014 un médicament plus efficace que les autres médicaments autorisés pour traiter les crises d’angioedème héréditaire (AOH) : notre protéine recombinante est identique à la protéine humaine et hautement purifiée alors que les produits concurrents sont eux isolés à partir de plasma humain, ne sont pas aussi bien purifiés et ne garantissent pas un médicament aussi sûr . Aujourd'hui, nous souhaitons améliorer la quantité et la qualité des protéines recombinantes produites dans le lait de lapines transgéniques en augmentant le niveau et l'efficacité de la production de la protéine d’intérêt, grâce à des outils de modifications du génome plus efficaces. Cela aura pour effet d’augmenter la durée de vie de la protéine recombinante dans l’organisme du patient et ainsi diminuer le nombre d’injections et la dose à injecter. Ces bénéfices pour l’Homme auront des avantages pour l’animal car produire des protéines recombinantes de meilleure qualité nous permettra de diminuer le nombre d'animaux dont nous aurions eu besoin pour produire ce médicament. Le deuxième bénéfice attendu de ce projet est de régénérer les lignées d'animaux transgéniques produisant notre médicament commercialisé afin de pouvoir soigner le plus de patients possibles, de réaliser de nouvelles études pré-cliniques et cliniques car cette protéine a un grand potentiel thérapeutique pour d'autres maladies comme le Covid-19.
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale (par exemple, injections, procédures chirurgicales)? Indiquer le nombre et la durée de ces procédures.
Les animaux vigiles recevront des injections sous-cutanées, intra-musculaires et des injections intraveineuses mais dans ce cas, sous anesthésie locale. Pour la procédure 1, obtention de gamètes femelles, les lapines vigiles reçoivent 2 injections sous-cutanées par jour pendant 2,5 jours, 1 injection intra-veineuse sous anesthésie locale. Cette procédure est prévue pour 1006 femelles. Pour la procédure n°2, vasectomie, 10 mâles subiront une seule chirurgie sous anesthésie générale (30 min). Pour la procédure n°3, transfert d’embryons chez une lapine receveuse, les lapines vigiles reçoivent 1 injection intra-veineuse sous anesthésie locale, 2 injections intramusculaires et 4 injections sous-cutanées (liées à l’anesthésie et aux soins post-opératoires) et une chirurgie sous anesthésie générale (30 min). Cette procédure est prévue pour 440 femelles. - Pour la procédure n°4, Césarienne, les lapines ont une chirurgie sous anesthésie générale (30 min) et reçoivent 2 injections intramusculaires et 4 injections sous-cutanées, liées à l’anesthésie et aux soins post-opératoires. Cette procédure est estimée pour 22 femelles - Pour la procédure n°5, prélèvements de sang, 212 lapins vigiles auront au maximum 2 prélèvements de sang (< 2 min) au cours de leur vie. - Pour la procédure n°6, prélèvement de lait, 205 lapines recevront une injection en intra-veineuse sous anesthésie locale, 1 fois par jour pendant la durée de la lactation, de J3 à J30 après la mise-bas, et ce uniquement les jours de semaine. Elles sont donc traites une fois par jour (10 min) pendant 20 jours environ. Concernant l’euthanasie des animaux, elle se fait majoritairement en intraveineuse mais il peut arriver qu’elle soit réalisée en intracardiaque sur des animaux précédemment anesthésiés (par une injection intramusculaire d’un mélange de kétamine et xilazyne).
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux, par exemple, douleur, perte de poids, inactivité/mobilité réduite, stress, comportement anormal, et la durée de ces effets?
Les lignées d'animaux transgéniques créées et renouvellées ne subiront aucune nuisance ou effet indésirable car les outils de biologie moléculaire que nous utilisons sont de classe 1, c'est à dire, sans effet sur l'Homme, les animaux et l'environnement. Les animaux transgéniques ne présentent aucun phénotype différent des animaux de génotype sauvage, seule la composition du lait produit lors de la lactation de la lapine transgénique est légèrement différente, et n'entraine d'ailleurs aucun trouble de croissance des lapereaux.
Quelles espèces et combien d’animaux est-il prévu d’utiliser? Quels sont le degré de gravité des procédures et le nombre d’animaux prévus dans chaque catégorie de gravité (par espèce)?
Espèce
Nombre total
Nombre estimé par degré de gravité
Sans réveil
Légère
Modérée
Sévère
Lapins (Oryctolagus cuniculus)
1895
Qu’adviendra-t-il des animaux maintenus en vie à la fin de la procédure?
Espèce
Nombre estimé d’animaux à réutiliser, à replacer dans l’habitat/le système d’élevage ou à proposer à l’adoption
Réutilisé
Replacé dans l’habitat naturel ou le système d’élevage
Proposé à l’adoption
Lapins (Oryctolagus cuniculus)
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
La procédure obtention de gamètes femelles, est classé légère mais suivie d'une euthanasie car nous ne pouvons pas récupérer les gamètes sans récupérer les tractus génitaux. Cela implique de devoir euthanasier la lapine donneuse de gamètes. Concernant la procédure 2, vasectomie, nous avons besoin des mâles pour qu’ils stimulent l’ovulation des lapines donneuses d’ovocytes, mais sans les féconder, c’est pourquoi les animaux seront gardés en vie après avoir été opérés. Le transfert d’embryon dans une lapine receveuse a pour but de placer des embryons dans l’utérus d’une femelle pour qu’ils puissent se développer et devenir des lapereaux. Les lapines opérées dans le cadre de cette procédure seront gardées en vie pendant quelques mois et nous les utiliserons ensuite soit pour un nouveau transfert soit pour la procédure « obtention de gamètes femelles ». La césarienne, qui ne sera réalisée qu’en cas de difficulté de la lapine à mettre bas, a le même but : nous permettre d’obtenir des lapereaux vivants, qui auront besoin de leur mère pour être nourris et élevés. Les procédures qui consistent à prélever du sang et du lait sur les lapins, ont pour but de nous permettre de déterminer si nous avons atteints nos objectifs. Ces animaux seront laissés en vie après la procédure et remis dans l’élevage.
1. Remplacement
Indiquer quelles sont les alternatives non animales disponibles dans ce domaine et pourquoi elles ne peuvent pas être utilisées aux fins du projet.
La production de protéines recombinantes dans le lait de lapines transgéniques est le principe fondateur de notre société et n’est pas remplaçable. Concernant le projet de renouvellement, nous avons essayé d’inséminer des lapines avec de la semence décongelée de mâles transgéniques InhC1 de 1ères et 2èmes générations mais avec un succès très limité. Le stock de paillettes de semence s’épuisant, il est nécessaire de trouver une alternative : l’ICSI (injection intracytoplasmique de sperme) .
2. Réduction
Expliquer comment le nombre d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé. Décrire les mesures prises pour réduire le nombre d’animaux à utiliser et les principes appliqués pour concevoir les études. S’il y a lieu, décrire les pratiques qui seront appliquées tout au long du projet pour limiter le plus possible le nombre d’animaux utilisés sans perdre de vue les objectifs scientifiques. Ces pratiques peuvent notamment consister en études pilotes, modélisation informatique, partage et réutilisation des tissus.
Pour l'optimisation de la production des protéines, nous mettons au point des tests prédictifs d'efficacité de nos vecteurs dans des lignées cellulaires. Nous souhaitons à terme, pouvoir tester tous les vecteurs de nos cibles génomiques afin de pouvoir pré-sélectionner les plus efficaces avant de passer à la micro-injection dans des embryons au stade 1 cellule et ainsi diminuer le nombre total d’animaux utilisés pour ce projet. Pendant cette mise au point, nous testons l’efficacité de nouveaux outils d’ingéniérie génétique en laissant en culture des embryons micro-injectés, jusqu’à ce qu’ils aient 5 jours (stable morulae/blastocyste) et nous réalisons ensuite leur génotypage pour vérifier l’efficacité des outils choisis . Cela nous permet de diminuer le nombre d’animaux utilisées pour un transfert d’embryon, de ne pas faire naître des animaux qui n’ont pas d’intérêt scientifique. Une fois les nouveaux outils validés, nous réitérons l’expérience en transférant cette fois les embryons micro-injectés dans des lapines dites receveuses. Les cibles génétiques sélectionnées concernent soit la production des protéines récombinantes soit l’amelioration de glycosylation de ces protéines récombinants. Les lapines reçoivent un traitement de super-ovulation qui, en moyenne, double le nombre d’ovocytes émis lors de l’ovulation (passe de 15 à 30, en moyenne), ce qui permet de diminuer par deux le nombre de lapines à utiliser. Après transfert, gestation et/ou lactation, les femelles receveuses d’embryons sont ré-utilisées en tant que femelles donneuses d’ovocytes ou d’embryons. L’optimisation de l’utilisation des lapines nous permet de réduire de moitié le nombre d’animaux utilisés réaliser la procédure « obtention de gamètes femelles ».
3. Raffinement
Donner des exemples des mesures spécifiques qui seront prises (par exemple, surveillance accrue, soins postopératoires, gestion de la douleur, entraînement des animaux) pour réduire au minimum les effets sur le bien-être des animaux (les nuisances causées). Décrire les mécanismes permettant d’intégrer de nouvelles techniques de raffinement pendant la durée de vie du projet.
Les lapins reçoivent des enrichissements dès trois semaines de vie, et les parois latérales de leurs cages sont équipées de plexiglas transparent, ce qui leur permet d’interagir. Leurs cages sont aussi équipées de plateforme qui leur permettent de mettre en œuvre leur comportement naturel de se cacher. De la musique est diffusée en salle d’hébergement pour diminuer le stress et les bruits environnementaux. Les gestes invasifs associés aux procédures sont faits sous anesthésie locale et/ou générale et les animaux recoivent des anti-inflammatoires locaux et généraux après chaque intervention. Notre protocole post-opératoire est mis en œuvre pour assurer le plus de confort et le moins de douleur à l’animal par l’application de produits cicatrisants et désinfectants en spray (pour ne pas toucher la zone potentiellement douloureuse), par l'injection d’anti-inflammatoire les 3 jours suivants l’opération, par la pose d’une collerette pour éviter que l’animal ne mange ses points de suture, pendant 10 jours environ après l’opération. La quantité d'aliment est augmentée pour que la lapine puisse accéder à sa nourriture facilement.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents
Le lapin (de souche New Zealand White) a été choisi pour : sa courte période de gestation (32-33 jours), sa maturation sexuelle rapide (4 à 5 mois), le volume de lait produit (jusqu’à 10 litres/an/femelle), la synthèse de protéines complexes (glycosylation et gamma carboxylation). Les lapines sont utilisées dès qu'elles ont atteint la maturité sexuelle, à 4 mois : Elles peuvent être utilisées comme receveuse d'embryons, par réimplantation chirurgicale d'embryons. Elles peuvent être super-ovulées et accouplées (ou non) avec des mâles pour être fécondées et être donneuses de gamètes. Les mâles sont utilisés comme reproducteurs à partir de 5 mois, lorsqu’ils ont atteint la maturité sexuelle, pour générer une descendance.
Raisons de l’appréciation rétrospective
Prévoit des procédures sévères
Utilise des primates non humains
Explication de l’autre raison de l’appréciation rétrospective