Uzyskanie myszy z nokautem funkcjonalnym za pomocą edycji genomu w jednokomórkowych zarodkach metodą CRISPR/Cas9
Identyfikator SND
NTS-PL-490696 v.1, 24-02-2025
Identyfikator krajowy SND
Pole nie zostanie opublikowane.
Państwo
Polska
Język
pl
Składany na poziomie UE
Pole nie zostanie opublikowane.
tak
Czas trwania projektu wyrażony w miesiącach.
24
Słowa kluczowe
nokaut funkcjonalny
CRISPR/Cas9
elektroporacja in situ
Cel(e) projektu
Badania podstawowe: Badania obejmujące wiele układów
Cele i przewidywane korzyści projektu
Proszę opisać cele projektu (na przykład zbadanie pewnych niewiadomych naukowych lub odpowiedzenie na potrzeby naukowe lub kliniczne).
W 2018 roku ukazała się praca zespołu japońskiego pt. i-GONAD: a robust method for in situ germline genome engineering using CRISPR nucleases (Ohtsuka i wsp). Opisano w niej przydatność elektroporacji in situ do wprowadzania zmian w genomie (czyli edycji genomu) w zarodkach mysich – uzyskano wydajność nokautu genowego rzędu kilkudziesięciu procent. Technologia i-GONAD (improved-Genome editing via Oviductal Nucleic Acids Delivery, czyli ulepszona edycja genomu poprzez dostarczanie kwasów nukleinowych poprzez jajowód) jest wygodniejsza i prostsza w uzyskiwaniu myszy z nokautem genowym niż metody bazujące na manipulacji zarodkami ex vivo. Naszym celem jest wdrożenie w naszym ośrodku tej metody (opisanej w szczegółach również w innych publikacjach), czyli wprowadzenie zmian do genomu w jednokomórkowych zarodkach myszy za pomocą jednej z najnowszych metod inżynierii genetycznej, tj. CRISPR/Cas9. Komponenty systemu CRISPR/Cas9 (kwasy nukleinowe, w tym przypadku sgRNA, i białko Cas9) zaprojektowane tak, by zmodyfikować konkretne miejsce w genomie, muszą być dostarczone do wnętrza komórki, w naszym przypadku do jednokomórkowych zarodków znajdujących się w bańce jajowodu (w najszerszej części jajowodu tuż za lejkiem). Wykorzystamy klasyczne metody indukujące przejściowe zmiany błony komórkowej, co umożliwia przejście komponentów systemu przez błonę komórkową (czyli transfekcję): elektroporację (zastosowanie krótkotrwałego impulsu elektrycznego w celu utworzenia por/otworów w błonie komórkowej) oraz komercyjnie dostępne odczynniki do transfekcji na bazie pęcherzyków lipidowych (liposomów). Planujemy uzyskanie myszy z nokautem funkcjonalnym genów Pmaip1, Hsf1 oraz Apoe do badań apoptozy indukowanej stresem termicznym (Pmaip1, Hsf1) oraz badań udziału białka HSF1 w metabolizmie cholesterolu i formowaniu blaszek miażdżycowych (Hsf1, Apoe) (badania prowadzone w aktualnych i planowanych projektach naukowych).
Jakie są potencjalne korzyści wynikające z tego projektu? Należy wyjaśnić, w jaki sposób projekt może przyczynić się do postępów w nauce, lub też jakie ostateczne korzyści mogą z niego czerpać ludzie, zwierzęta lub środowisko. W stosownych przypadkach należy wprowadzić rozróżnienie między korzyściami krótkoterminowymi (w czasie trwania projektu) i długoterminowymi (które mogą się pojawić po zakończeniu projektu).
Myszy z nokautem genowym są ważnym elementem badań podstawowych. Umożliwiają badania funkcji genów w myśl zasady: "zepsuj i zobacz na co to wpłynie". Dzięki nokautom stworzono mysie modele wielu chorób (w tym miażdżycy tętnic). Sposób uzyskania myszy z nokautem genowym zaproponowany w niniejszym wniosku jest najprostszym z możliwych. Zastępuje pracochłonną i długą procedurę rekombinacji homologicznej w embrionalnych komórkach zarodkowych połączoną z koniecznością tworzenia chimer i ich implantacji w macicy matek zastępczych. Są też inne metody wykorzystujące CRISPR/Cas9, z tym, że stosuje się w nich mikroiniekcję do 1-komórkowych zarodków, co również wymaga pracy z zarodkami ex vivo i matek zastępczych oraz posiadania specjalistycznego i drogiego sprzętu. W proponowanej procedurze, praca z zarodkami ex vivo oraz matki zastępcze nie są potrzebne.
Przewidywane szkody
W jakich procedurach będą zazwyczaj stosowane zwierzęta (na przykład wstrzykiwanie, zabiegi chirurgiczne)? Proszę wskazać liczbę i czas trwania tych procedur.
Samice myszy (maksymalnie 140 sztuk; jednorazowo 10 sztuk) będą szczepione niskimi dawkami PMSG (jedna mysz ok. 10-20 sekund) w celu synchronizacji cyklu rujowego i krzyżowane dwa dni później z samcami. Do operacji, w której komponenty systemu CRISPR/Cas9 będą wprowadzane do jednokomórkowych zarodków bezpośrednio w bańce jajowodu, wykorzystane zostaną tylko zapłodnione samice (maksymalnie 70 sztuk; jednorazowo ok. 5 sztuk; operacja jednej samicy: 20-30 minut). Po urodzeniu młodych (ciąża 19-21 dni), wszystkie urodzone osobniki (w wieku co najmniej 14 dni) będą znakowane i będzie pobierany materiał do genotypowania (ok. 1 min/mysz) (maksymalnie 350 sztuk).
Jakie są przewidywane/szkodliwe skutki dla zwierząt, na przykład ból, utrata masy ciała, brak aktywności / ograniczona mobilność, stres, nietypowe zachowania i czas trwania tych skutków?
Zaplanowane procedury nie będą wywoływać długotrwałego dyskomfortu lub cierpienia zwierząt. Zwierzęta będą narażone na krótkotrwały stres związany z unieruchomieniem bądź ukłuciem igły po podaniu PMSG lub środków znieczulających/przeciwbólowych oraz na biopsję ucha i ogona. Umiarkowany krótkotrwały ból pooperacyjny może towarzyszyć planowanemu zabiegowi chirurgicznemu. Będzie on łagodzony przez podanie odpowiednich środków przeciwbólowych.
Zgodnie z przewidywaniami jakie gatunki i jaka liczba zwierząt będą wykorzystywane? Jaka jest oczekiwana dotkliwość i liczba zwierząt w każdej kategorii dotkliwości (w podziale na gatunki)?
Gatunek
Łączna liczba
Szacunkowa liczba dla każdej kategorii dotkliwości
Terminalne
Łagodne
Umiarkowane
Dotkliwe
Myszy (Mus musculus)
490
0
420
70
0
Co stanie się ze zwierzętami utrzymanymi przy życiu po zakończeniu procedury?
Gatunek
Szacunkowa liczba zwierząt przeznaczonych do ponownego wykorzystania, przywrócenia do siedliska/systemu hodowlanego lub objętych programami znajdowania nowego domu
Do ponownego wykorzystania
Przywróconych
Objętych programami znajdowania nowego domu
Myszy (Mus musculus)
490
0
0
Proszę podać powody planowanego losu zwierząt po zakończeniu procedury.
Jeżeli zaplanowane procedury doprowadzą do uzyskania zwierząt z nokautem genowym, myszy pokolenia F0 lub F1 zostaną wykorzystane do założenia linii myszy z nokautem jednego oraz dwóch genów do dalszych badań naukowych. Będą one wykorzystane z zastosowaniem procedur objętych odrębnym wnioskiem do Lokalnej Komisji Etycznej ds. spraw doświadczeń na zwierzętach. Osobniki zbędne będą usuwane z hodowli zgodnie z obowiązującymi w NIO-PIB regułami (eutanazja z użyciem dwutlenku węgla; w pojedynczych przypadkach przez przerwanie ciągłości kręgów szyjnych).
Stosowanie zasady 3R
1. Zastąpienie
Proszę wskazać, jakie alternatywne rozwiązania bez wykorzystania zwierząt są dostępne w tej dziedzinie i dlaczego nie mogą być wykorzystane do celów projektu.
Sposób uzyskania myszy z nokautem genowym zaproponowany w niniejszym wniosku jest najprostszym z możliwych. Zastępuje pracochłonną i długą procedurę rekombinacji homologicznej w embrionalnych komórkach zarodkowych połączoną z koniecznością tworzenia chimer i ich implantacji w macicy matek zastępczych. Istnieją też metody wykorzystujące najnowsze zdobycze inżynierii genetycznej (CRISPR/Cas9), z tym, że stosuje się mikroiniekcję do 1-komórkowych zarodków, co również wymaga pracy z zarodkami ex vivo i matek zastępczych oraz posiadania specjalistycznego i drogiego sprzętu.
2. Ograniczenie
Proszę wyjaśnić, w jaki sposób określono liczbę zwierząt koniecznych do celów tego projektu. Proszę opisać kroki podjęte w celu ograniczenia liczby wykorzystywanych zwierząt oraz zasady zastosowane przy projektowaniu badania. W stosownych przypadkach, proszę opisać praktyki, które będą stosowane w całym projekcie w celu zminimalizowania liczby wykorzystywanych zwierząt zgodnie z celami naukowymi. Praktyki te mogą obejmować np. badania pilotażowe, modelowanie komputerowe, dzielenie się tkankami i ponowne wykorzystywanie.
Doświadczenia w Projekcie zostały zaplanowane w taki sposób aby ograniczyć do minimum liczbę zwierząt. W przypadku braku sukcesu po 3-4 doświadczeniach przy zastosowaniu różnych parametrów transfekcji w jajowodzie, doświadczenia nie będą kontynuowane.
3. Udoskonalenie
Proszę podać przykłady konkretnych środków (np. wzmożone monitorowanie, opieka pooperacyjna, terapie przeciwbólowe, trening zwierząt), które należy podjąć w związku z procedurami w celu zminimalizowania szkód dla dobrostanu zwierząt. Proszę opisać mechanizmy wprowadzania technik w zakresie łagodzenia szkód pojawiających się w czasie trwania projektu.
Doświadczenia zostały zaplanowane w taki sposób, aby do minimum ograniczyć cierpienie zwierząt. Zwierzęta będą trzymane w indywidualnie wentylowanych klatkach, w odpowiedniej dla nich temperaturze i wilgotności. Ich stan będzie monitorowany przez wykwalifikowany personel oraz otoczone będą opieką weterynaryjną (siedem dni w tygodniu). Myszy będą miały całodobowy dostęp do świeżej wody i specjalistycznej paszy. W celu wzbogacenia środowiska w klatkach oprócz podstawowej, niepylącej, chłonnej ściółki osikowej będzie również ściółka przeznaczona do budowy gniazd. W pomieszczeniu hodowlanym będzie zachowany 12 godzinny cykl dobowy światła (dzień/noc).
Proszę wyjaśnić wybór gatunków i powiązanych etapów życia.
"Myszy są jednym z podstawowych modeli doświadczalnych. W doświadczeniu zostanie wykorzystanych maksymalnie 140 samic szczepów C57BL/6, FVB/N lub F1 C57BL/6 x FVB/N oraz około 350 zwierząt będzie genotypowane. Model myszy jest powszechnie wykorzystywany do tego typu badań. Posiadamy odpowiednie doświadczenie oraz sprzęt pozwalający na prowadzenie badań na myszach jak również zapewnienia im odpowiednich warunków życia.
Zamierzonego przez nas celu nie można osiagnąć z wykorzystaniem metod alternatywnych bez wykorzystania zwierząt. "