Décrire les objectifs du projet (par exemple, répondre à certaines interrogations scientifiques ou à des besoins scientifiques ou cliniques).
Les bactéries pathogènes Escherichia coli adhérentes et invasives (Adherent Invasive Escherichia coli, AIEC) ont été isolées dans l’intestin de patients atteints de la maladie de Crohn mais sont absentes chez les sujets sains. La maladie de Crohn est caractérisée par une dérégulation de la réponse immunitaire au sein de la muqueuse intestinale, notamment des réponses lymphocytaires, conduisant à l’installation d’une inflammation chronique. Ce projet vise à étudier comment les bactéries AIEC pourraient contribuer à initier et/ou à entretenir une réponse lymphocytaire T et/ou B intestinale anormale similaire à celle observé dans la maladie de Crohn. Plus précisément, les objectifs du projet sont les suivants : 1. Etablir dans notre animalerie la lignée de souris nécessaire au projet 2. Tester chez la souris plusieurs modèles de colonisation intestinale par les bactéries AIEC afin de déterminer le meilleur modèle pour l’étude. 3. Caractériser la réponse des lymphocytes B et T aux AIEC dans le modèle choisi, en comparaison avec une E. coli contrôle non-AIEC. 4. Valider les résultats obtenus avec plusieurs autres souches AIEC issues de notre collection. 5. Etudier le rôle de gènes bactériens dans l'induction de la réponse immunitaire pathologique par les bactéries AIEC. 6. Evaluer le potentiel vaccinal d’antigènes-candidats pour limiter la colonisation et la réponse immunitaire pathologique aux bactéries AIEC.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet? Expliquer en quoi le projet pourrait faire progresser les connaissances scientifiques ou quels bénéfices les êtres humains, les animaux ou l’environnement pourraient en tirer à terme. Le cas échéant, distinguer les bénéfices à court terme (pendant la durée du projet) et les bénéfices à long terme (susceptibles d’être obtenus après l’achèvement du projet).
A court terme, ce projet fera progresser les connaissances sur la physiopathologie de la colonisation par les bactéries AIEC et leur position dans le déclenchement ou l’entretien de l’inflammation intestinale caractérisant la maladie de Crohn. Le rôle de gènes de virulence ou d’antigènes d’intérêt sera également étudié, ce qui permettra d’élucider les mécanismes sous-jacents. A moyen terme, ce projet inclut l’exploration du potentiel vaccinal des antigènes en question : si l’expérimentation confirme un intérêt vaccinal, cela constituerait une preuve de concept pour un projet plus ambitieux en vaccinologie qui portera ses fruits à plus long terme pour les patients. D’une manière générale, quels que soient les résultats, la compréhension des mécanismes de pathogénicité de AIEC à l’échelle moléculaire et cellulaire est indispensable pour identifier de nouvelles pistes de diagnostic et/ou thérapeutiques pour les patients.
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale (par exemple, injections, procédures chirurgicales)? Indiquer le nombre et la durée de ces procédures.
Dans le cadre de ce projet, les animaux pourront subir les gestes et contraintes suivants (tous les gestes seront réalisés par des personnels formés) : - consommation d'un régime riche en graisse et en sucres provoquant une prise de poids plus rapide. - contentions et gavages intragastriques (stress, éventuellement douleur légère, extrêmement rarement complications septicémiques; trois gavages par animal à 24h d'intervalle) - injection intraveineuse au sinus rétro-orbitaire sous anesthésie - prélèvements sanguins au sinus rétro-orbitaire sous anesthésie dans le respect des volumes recommandés (jusqu'à trois prélèvements par animal, espacés d'une semaine au minimum). - injections sous-cutanée ou intramusculaire (administration d’antalgiques pour garantir le bien-être animal dans les cas décrits dans les procédures, essai vaccinal dans la procédure 7). - traitement antibiotique dans l’eau du biberon pouvant provoquer une légère inflammation intestinale associée à une légère perte de poids. - isolement bref (inférieur à une heure) dans une enceinte fermée permettant la collecte de fèces fraîches (répété jusqu'à trois fois par semaine)
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux, par exemple, douleur, perte de poids, inactivité/mobilité réduite, stress, comportement anormal, et la durée de ces effets?
Les gestes et contraintes nécessaires à la réalisation de ce projet peuvent occasionner chez les animaux du stress et une douleur légère (contention, gavage, isolement, injections sous-cutanées ou intramusculaires) voire une douleur modérée (inflammation liée au régime occidental, aux antibiotiques et à l'administration de bactéries; douleur consécutive aux prélèvements au sinus rétro-orbitaire).
Quelles espèces et combien d’animaux est-il prévu d’utiliser? Quels sont le degré de gravité des procédures et le nombre d’animaux prévus dans chaque catégorie de gravité (par espèce)?
Espèce
Nombre total
Nombre estimé par degré de gravité
Sans réveil
Légère
Modérée
Sévère
Souris (Mus musculus)
2874
Qu’adviendra-t-il des animaux maintenus en vie à la fin de la procédure?
Espèce
Nombre estimé d’animaux à réutiliser, à replacer dans l’habitat/le système d’élevage ou à proposer à l’adoption
Réutilisé
Replacé dans l’habitat naturel ou le système d’élevage
Proposé à l’adoption
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Les animaux utilisés dans ce projet sont transgéniques et ne peuvent donc pas être replacés. Les animaux de génotype de non-intérêt mentionnés en procédure 1 seront utilisés pour la formation des manipulateurs (procédure 7) ou euthanasiés. En effet, ces animaux étant transgéniques, il ne sera a priori pas possible de les réutiliser dans d'autres projets. Parmi les animaux de génotype d'intérêt, certains seront utilisés pour l'expérimentation pour obtenir des splénocytes nécessaires aux procédures 2 à 6. Les autres animaux seront conservés comme reproducteurs pour entretenir la lignée. Concernant les procédures 2 à 6, les animaux de génotype de non-intérêt seront soit conservés pour d'autres projets faisant l'objet de leur propre DAP, soit utilisés pour la formation des manipulateurs (procédure 7) soit euthanasiés. Les animaux de génotype d'intérêt générés dans le cadre de ce projet seront soit conservés comme reproducteurs pour une part d'entre eux, soit utilisés dans les procédures expérimentales décrites et mis à mort pour permettre les prélèvements nécessaires pour le projet.
1. Remplacement
Indiquer quelles sont les alternatives non animales disponibles dans ce domaine et pourquoi elles ne peuvent pas être utilisées aux fins du projet.
L’expérimentation animale est indispensable pour ce projet : en effet, il n’existe pas à l’heure actuelle de méthode alternative permettant de rendre compte de la complexité d’une réponse immunitaire, qu’elle soit mucosale ou systémique. Si la procédure 5 est réalisée et permet d’identifier des souches bactériennes n’induisant pas la même réponse immunitaire pathologique que la souche de référence AIEC, nous pourrons envisager de tester ces souches dans des modèles de gut-on-chip disponibles dans des laboratoires collaborateurs (Bioaster, Lyon) afin d’établir des corrélats de réponse et de non-réponse dans ce modèle in vitro. A terme, cela pourrait nous aider à nous affranchir du modèle in vivo pour cribler d’autres mutants par la suite, mais pour l’instant nous ne disposons pas de données suffisantes.
2. Réduction
Expliquer comment le nombre d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé. Décrire les mesures prises pour réduire le nombre d’animaux à utiliser et les principes appliqués pour concevoir les études. S’il y a lieu, décrire les pratiques qui seront appliquées tout au long du projet pour limiter le plus possible le nombre d’animaux utilisés sans perdre de vue les objectifs scientifiques. Ces pratiques peuvent notamment consister en études pilotes, modélisation informatique, partage et réutilisation des tissus.
Le nombre d’animaux nécessaires a été évalué en fonction de la littérature et de l’expertise du laboratoire sur les modèles proposés de sorte à favoriser des résultats fiables et statistiquement significatifs (en particulier, implantation intestinale hétérogène des AIEC justifiant le recours à des lots de 10 animaux). Un maximum de prélèvements seront réalisés sur chaque animal après la mise à mort ; toutefois, certaines analyses prévues requièrent le traitement de l’intestin entier, augmentant ainsi le nombre d’animaux nécessaires. La procédure 5 ne sera réalisée que si nos travaux en cours ou ceux de nos collaborateurs identifient des gènes d’intérêt : nous prévoyons de limiter les tests aux cinq gènes les plus intéressants, mais il est possible que finalement il n’y ait pas autant de gènes testés. Les procédures 4, 5 et 6 ne seront réalisées que pour les paramètres expérimentaux donnant les résultats les plus significatifs (paramètres identifiés à l’issue de la procédure 3).
3. Raffinement
Donner des exemples des mesures spécifiques qui seront prises (par exemple, surveillance accrue, soins postopératoires, gestion de la douleur, entraînement des animaux) pour réduire au minimum les effets sur le bien-être des animaux (les nuisances causées). Décrire les mécanismes permettant d’intégrer de nouvelles techniques de raffinement pendant la durée de vie du projet.
L’entretien des lignées transgéniques sera réalisé dans les conditions standard d’hébergement (4 à 7 souris par cage, libre accès à l’eau et à la nourriture, enrichissement par des igloos de cellulose vierge densifiée et apport de matériel de nidification). Pour l’expérimentation, les animaux seront transférés dans des cages ventilées en condition standard. Une période d’acclimatation de 7 jours sera respectée avant le début du protocole d’infection. Un enrichissement est apporté dans les cages : cachettes en polycarbonate teinté rouge préalablement lavées et stérilisées, et galets de lanières de papier compactées. Le bien-être des animaux sera régulièrement évalué par du personnel formé grâce à une grille de score tenant compte de l'apparence de l'animal, de son poids, des signes d'inflammation digestive et du comportement. La surveillance sera quotidienne et les animaux seront pesés chaque jour à partir du début de l'expérimentation. Des mesures simples telles que le dépôt de croquettes directement dans la cage ou le changement de biberon pour un biberon à tétine longue pourront être prises en cas de signes de douleur abdominale chez certaines souris. Un animal présentant un score alarmant recevra un traitement contre la douleur. Si le score atteint le point limite, les souris seront euthanasiées immédiatement (selon l’avancement de l’expérimentation, des prélèvements pourront être réalisés juste avant la mise à mort sous anesthésie et/ou en post-mortem).
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents
Le choix du modèle souris est lié à cinq paramètres essentiels : - Existence des lignées transgénique nécessaire au projet - Modèle validé pour étudier les réponses immunitaires - Disponibilité des outils moléculaires pour cette espèce (anticorps, cytokines recombinantes…) - Importance des données bibliographiques déjà publiées sur la réponse immunitaire mucosale - Importance des données déjà acquises par notre laboratoire sur l'infection des souris par les AIEC La maladie de Crohn est une pathologie se déclarant chez le jeune adulte (pic de diagnostic entre 15 et 30 ans). En conséquence, nous utiliserons les souris à un âge équivalent. Pour les souris sous régime alimentaire conventionnel, les expérimentations débuteront sur des animaux âgés de 6 semaines (5 semaines + 1 semaine d’acclimations) et pourront se poursuivre jusqu’à l’âge de 10-11 semaines (pour les plus longs temps post-infection). Pour les souris sous régime riche en graisse et en sucre, le régime sera donné à l’âge de 4 semaines, le protocole d’infection débutera à l’âge de 10 semaines et pourra se poursuivre jusqu’à 14 semaines pour les plus longs temps post-infection.
Raisons de l’appréciation rétrospective
Prévoit des procédures sévères
Utilise des primates non humains
Explication de l’autre raison de l’appréciation rétrospective