Décrire les objectifs du projet (par exemple, répondre à certaines interrogations scientifiques ou à des besoins scientifiques ou cliniques).
Les maladies inflammatoires et/ou douloureuses chroniques (comme les maladies auto-immunes et allergiques) représentent un problème majeur de santé publique et les approches thérapeutiques utilisées aujourd’hui ne donnent pas entière satisfaction. Il est donc important de comprendre la physiopathologie de ces maladies au niveau cellulaire et moléculaire afin de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. De nombreux facteurs environnementaux ont été décrits comme participant à la genèse de ces pathologies ou comme facteurs facilitateurs de la mise en place de ces maladies chroniques. Parmi ces facteurs environnementaux, de nombreuses études épidémiologiques placent le stress et les infections bactériennes comme les facteurs majeurs impliqués dans la régulation de la douleur et de l'immunité. L'objectif de notre projet est de comprendre l'association qui pourrait exister entre le stress et l'infection dans la mise en place du système immunitaire intestinal et de la sensibilité viscérale.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet? Expliquer en quoi le projet pourrait faire progresser les connaissances scientifiques ou quels bénéfices les êtres humains, les animaux ou l’environnement pourraient en tirer à terme. Le cas échéant, distinguer les bénéfices à court terme (pendant la durée du projet) et les bénéfices à long terme (susceptibles d’être obtenus après l’achèvement du projet).
Ce projet de recherche devrait nous permettre de mettre en évidence le rôle du stress et de l'infection au cours de la gestation sur le développement de maladie chronique chez la descendance. Il s'inscrit dans le concept beaucoup plus large des 1000 premiers jours de vie. En effet, beaucoup de grands systèmes (nerveux, immunitaires, intestinaux…) s’établissent au cours des 1000 premiers jours de vie de l’enfant en parallèle et de façon interdépendante de l’établissement du microbiote intestinal. Le stress et les infections bactériennes interagissent avec tous ces systèmes et peuvent donc avoir des conséquences à long terme sur la santé de l’individu. Les retombées immédiates de ce projet seront une meilleure connaissance de l'implantation du microbiote intestinal en lien avec la maturation du système immunitaire, de l'infection chez l'enfant, de l'impact du stress lors de la grossesse et de l’impact de ces perturbations sur la mise en place de maladie chronique à l’âge adulte. Nos analyses biologiques devraient permettre de déterminer des biomarqueurs permettant une prise en charge ciblée de ces pathologies.
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale (par exemple, injections, procédures chirurgicales)? Indiquer le nombre et la durée de ces procédures.
Pour générer des souris F1 issues de mères stressées, 84 femelles seront placées dans un tube de contention sous une lumière vive durant 30 min, 3 fois par jour, pendant 6 jours, du 13ème jour au 18ème jour de gestation. Pour une étude, sur les 576 souris F1, la moitié sera soumise à une simple infection par citrobacter rodentium par gavage sur animaux vigiles à la 3ième semaine de vie. Sur la moitié des souris infectées ou non infectées, soit 288 souris, la douleur viscérale sera déterminée par distension colorectale suite à l’implantation d’électrodes sous anesthésie chirurgicale (environ 1h) à la 8ième semaine de vie. La perméabilité paracellulaire sera évaluée soit à la 5ième semaine de vie, soit à la 8ième semaine de vie, avec un gavage oral de Dextran-FITC sur animaux vigiles et un prélèvement sanguin mandibulaire après anesthésie gazeuse. Pour une deuxième étude, sur les 576 souris F1, la moitié des souris sera soumise à une simple infection par citrobacter rodentium par gavage sur animaux vigiles à la 3ième semaine de vie. Sur l’ensemble des 576 animaux, le comportement anxieux sera évalué par le test du labyrinthe en croix surélevé sur animaux vigiles à la 5ième semaine de vie (288 souris) ou à la 8ième semaine de vie (288 souris). La perméabilité paracellulaire sera évaluée soit la 5ième semaine de vie (288 souris) ou à la 8ième semaine de vie (288 souris) avec un gavage oral de Dextran-FITC sur animaux vigiles et un prélèvement sanguin mandibulaire après anesthésie gazeuse. Dans une dernière partie de l’étude, sur les 864 souris, 288 des souris F1 seront soumis à une simple infection par citrobacter rodentium par gavage sur animaux vigiles à la 8ième semaine de vie alors que 288 souris seront soumises à une double infection par 2 gavages, un gavage à la 3ième semaine de vie et un gavage à la 8ième semaine de vie sur animaux vigiles. Sur la moitié des souris soit 432, la douleur viscérale sera déterminée par distension colorectale suite à l’implantation d’électrodes sous anesthésie chirurgicale (environ 1h) à la 10ième semaine de vie sur l’ensemble. Sur l’autre moitié des souris soit 432, le comportement anxieux sera évalué par le test du labyrinthe en croix surélevé sur animaux vigiles à la 10ième semaine de vie. La perméabilité paracellulaire sera évaluée à la 10ième semaine de vie avec un gavage oral de Dextran-FITC sur animaux vigiles et un prélèvement sanguin mandibulaire après anesthésie gazeuse pour tous les animaux.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux, par exemple, douleur, perte de poids, inactivité/mobilité réduite, stress, comportement anormal, et la durée de ces effets?
Ce modèle de stress prénatal n'induit pas de douleur spontanée chez la souris. Nous attendons le premier jour de la procédure de stress une stabilisation du poids ou une perte de moins de 3.5% du poids des mères gestantes en comparaison avec les mères gestantes non stréssées. Dès le deuxième jour de la procédure de stress les mères gestantes doivent reprendre du poids. Le stress réalisé sur les mères gestantes ne comporte pas d'effet visible comportemental. Le stress prénatal entraine chez la descendance des comportements anxieux et dépressifs observés tout au long de la vie et révélés à l’aide de test comme le labyrinthe en croix surélevé. Ces comportements n’ont cependant pas d’impact sur la prise alimentaire ou la croissance des animaux. L’infection par citrobacter rodentium entraine une réponse inflammatoire colique transitoire (entre le 5ème et le 15ème jours post gavage). Lors de la colite, les souris souffrent de diarrhée, de présence de sang dans les selles et d’une perte de poids. La bactérie n’est plus détectée dans les selles 21 jours après le gavage. Trente jours après le gavage, les souris ne présentent plus de signes macroscopiques d’inflammation. Au niveau microscopique, elles présentent un épaississement de la muqueuse et de la musculeuse du colon. De nombreuses études ont utilisé l’infection par citrobacter rodentium, les doses que nous allons utiliser dans notre étude ont été décrites comme n’ayant pas d’impact sur la survie. Après la chirurgie, les animaux seront placés en cage individuelle pendant 4 jours au maximum afin d'éviter qu'ils ne se mangent les électrodes. Nous ne pouvons pas replacer les animaux ensemble, car sans les électrodes nous ne pouvons pas enregistrer l'activité musculaire au cours de la distension colorectale.
Quelles espèces et combien d’animaux est-il prévu d’utiliser? Quels sont le degré de gravité des procédures et le nombre d’animaux prévus dans chaque catégorie de gravité (par espèce)?
Espèce
Nombre total
Nombre estimé par degré de gravité
Sans réveil
Légère
Modérée
Sévère
Souris (Mus musculus)
2856
Qu’adviendra-t-il des animaux maintenus en vie à la fin de la procédure?
Espèce
Nombre estimé d’animaux à réutiliser, à replacer dans l’habitat/le système d’élevage ou à proposer à l’adoption
Réutilisé
Replacé dans l’habitat naturel ou le système d’élevage
Proposé à l’adoption
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Les animaux ayant servi à générer la descendance F1 seront mis à mort après le sevrage des F1 et des prelèvements d'organes seront réalisés. Les souris F1 après simple infection seront euthanasiées à différents âges : soit à 5 semaines de vie soit à 8 semaines de vie. Les souris F1 après double infection seront euthanasiées à 10 semaines de vie. Des prélèvements tissulaires seront collectés pour différentes études au niveau cellulaire et moléculaire.
1. Remplacement
Indiquer quelles sont les alternatives non animales disponibles dans ce domaine et pourquoi elles ne peuvent pas être utilisées aux fins du projet.
Les méthodes alternatives, permettant une évaluation du statut immunitaire et douloureux de l'animal sont peu représentatives de la pathologie humaine. Ainsi, ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale afin de valider de nouvelles cibles thérapeutiques pour les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin. De plus, la douleur, le stress, l'infection et l'inflammation sont des réactions intégrées de l'organisme entier impossible à reproduire in vitro dans leur intégralité.
2. Réduction
Expliquer comment le nombre d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé. Décrire les mesures prises pour réduire le nombre d’animaux à utiliser et les principes appliqués pour concevoir les études. S’il y a lieu, décrire les pratiques qui seront appliquées tout au long du projet pour limiter le plus possible le nombre d’animaux utilisés sans perdre de vue les objectifs scientifiques. Ces pratiques peuvent notamment consister en études pilotes, modélisation informatique, partage et réutilisation des tissus.
Pour ce modèle, les animaux seront suivis régulièrement au cours du temps par des techniques non invasives comme le suivi du poids, la consistance des fèces et la présence de sang dans les fèces évaluée par le test HémoccultII® et de façon plus spécifique par l'analyse des scores cliniques pour l'infection. L’utilisation de ces techniques non-invasives permet d’observer au cours du temps un seul animal, là où l’information devait être obtenue par euthanasie et autopsie de multiples individus à chaque stade d’une seule étude, permettant ainsi de réduire sensiblement le nombre d’animaux. Le nombre de 12 animaux par groupe expérimental est le minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs, principalement due à la variabilité interindividuelle des réponses étudiées. Nous utiliserons des analyses non paramétriques, le test Kruskal-wallis suivie d'un test post-hoc de Dunn pour les analyses multi-groupes et le test de Wilcoxon-Mann-Whitney pour les analyses concernant deux groupes.
3. Raffinement
Donner des exemples des mesures spécifiques qui seront prises (par exemple, surveillance accrue, soins postopératoires, gestion de la douleur, entraînement des animaux) pour réduire au minimum les effets sur le bien-être des animaux (les nuisances causées). Décrire les mécanismes permettant d’intégrer de nouvelles techniques de raffinement pendant la durée de vie du projet.
Afin de suivre la directive européenne 2010/63/UE, un enrichissement sera rajouté aux animaux. A savoir, dans un premier temps, des carrés de coton pur ou du papier absorbant permettant aux animaux de faire une nidation. Selon la durée de l’étude, un deuxième enrichissement pourra être introduit dans l’environnement, tel que des aspen Brick, des tunnels en polycarbonate ou des igloos. Une étude rétrospective sera effectuée à la fin de chaque expérience pour déterminer les possibilités de diminution du nombre d'animaux et/ou d'amélioration des procédures pour diminuer la souffrance animale. Durant toute la période d’expérimentation, l’état général des animaux sera observé quotidiennement. Une veille bibliographique sera effectuée pour déterminer si des méthodes de remplacement ont été mise en place. Pour chaque procédure des points limites ont été définis pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal et l'animal sera euthanasié s’il présente un de ces points limites d’arrêt de la procédure.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents
La souris présente des caractéristiques physiopathologiques proches de l'espèce humaine. Nous disposons également de souris déficientes pour l'expression de certains gènes cibles. Ces souris déficientes pourront, si ce projet aboutit, faire l'objet d'une nouvelle demande. Les mères seront stressées du 13 au 18 éme jours de gestation. C'est la période décrite dans la littérature pour ce modèle. Ensuite les souris F1 seront utilisées soit à 5 semaines de vie pour évaluer l'impact direct su stress et de l'infection avant le sevrage, soit à 8 semaines de vie pour évaluer l'impact du stress et de l'infection sur des animaux adultes et matures. D'autres souris F1, infectées ou non par citrobacter rodentium à la 3ième semaine de vie et ré-infectées à la 8ième semaine de vie pour évaluer l'éducation du système immunitaire vis-à-vis ce cette bactérie pathogène, seront utilisées à la 10ième semaine de vie.
Raisons de l’appréciation rétrospective
Prévoit des procédures sévères
Utilise des primates non humains
Explication de l’autre raison de l’appréciation rétrospective